內皮祖細胞移植對擴張型心肌病大鼠血管新生的影響

[摘要] 目的 探討內皮祖細胞(EPC)對擴張型心肌病大鼠心肌內血管新生的影響。方法 50只雌性SD大鼠于腹股溝皮下注射異丙腎上腺素，250mg/kg，連續(xù)2d，制作擴張型心肌病(DCM)模型。隨機分為EPC治療組和對照組;心臟彩超評估心功能情況免疫組化方法檢測心肌細胞內的血管密度。結果 細胞移植3個月后EPC組心肌內血管密度高于對照組。結論 心肌內移植EPC是治療擴張型心肌病的有效方法，安全，可行。

[關鍵詞] 內皮祖細胞;擴張型心肌病;血管新生

[中圖分類號] R542.2 [文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701(2010)12-09-02

The Effects of Endothelial Progenitor Cells on Neovascularization for Dilated Cardiomyopathy Rats

ZHANG XinWANG DeqiangZHENG YuyunGUO Xiaohua

Department of Cardiology，the First Affiliated to Baotou Medical College，Baotou 014010，China

[Abstract] Objective To study effects of endothelia progenitor cells(EPCs) on neovascularization for dilated cardiomyopathy(DCM) rats. Methods Fifty adult female rats received inguinal subcutaneous injections of isoproterenol(ISO，250mg/kg) for induction of DCM. And the model rats were randomly divided into EPCs group and control group. The echocardiographic examination and myocardial capillary density were performed. Results Three months after transplantation，there was higher capillary density in EPCs group. Conclusion Transplantation of EPCs can improve cardiac function，induce neovascularization for DCM. The treatment with EPCs has better effect.

[Key words] Endothelia progenitor cell;Dilated cardiomyopathy;Neovascularization

內皮祖細胞(EPC)是能夠分化為內皮細胞的干細胞。眾多國內外研究表明，EPC能夠修復受損血管的內膜并在缺血部位形成血管[1]。EPC通過分化、增殖，并融合到原有血管的內膜層，促使新的血管網(wǎng)的形成[2]，也能通過分泌多種細胞因子影響其周圍細胞的生物行為。擴張型心肌病典型的病理改變是心肌細胞丟失、微循環(huán)受損和心肌纖維化。本研究的目的是將內皮祖細胞移植到擴張型心肌病大鼠的心肌內，觀察內皮祖細胞對其心肌內血管新生的影響，為干細胞廣泛應用于臨床提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1動物模型的制作

50只雌性和12只雄性成年SD大鼠購于中國科學院實驗動物中心，體重170~ 220g，用于動物模型和細胞提取。將異丙腎上腺素(Sigma)用0.9%生理鹽水溶解，注射到大鼠腹股溝皮下，250mg/kg，每天1次，連續(xù)2d。所有大鼠術后分籠飼養(yǎng)4周，在室溫(24±1)℃的環(huán)境中自由進食和活動。

1.2骨髓單個核細胞的分離和內皮祖細胞的培養(yǎng)

12只正常雄性SD大鼠用過量氯胺酮(200mg/kg)麻醉處死，單個核細胞提取根據(jù)文獻提到的方法[2]。簡而言之，在無菌條件下，用0.9%生理鹽水反復沖洗脛骨、股骨的骨髓腔，用Ficoll -Paque(1.077g/mL，華精，上海)通過梯度密度離心法提取單個核細胞。細胞經(jīng)過三步洗滌后，用EGM-2培養(yǎng)液(Clonetics，USA)將細胞密度調整為0.5×106/mL，然后均勻地鋪在包被了纖維連結蛋白(10μg/mL，Chemicon，美國)的六孔板中，放于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中，每周更換2次培養(yǎng)液。

1.3EPCs表型分析

培養(yǎng)7d的EPCs與Dil標記的乙酰化的低密度脂蛋白(ac-LDL-DiI，10μg/mL，Biomed Tech，美國)37℃孵育4h，PBS洗3遍，1%的中性福爾馬林固定15min，在與FITC 標記的棘豆凝集素-1(UEA-1，10μg/mL，Sigma)37℃孵育1h，PBS洗3遍。熒光倒置顯微鏡(Olympus IX70)下觀察，拍照。

1.4EPCs心肌內注射

24只造模成功的大鼠隨機分為EPC組和對照組(n=12)，氯胺酮(100mg/kg)麻醉后，氣管插管，機械通氣(DW-2000，嘉鵬，上海)，潮氣量1mL/kg，頻率60次/min，打開左側胸腔，暴露心臟，找到心肌壞死部位，用帶有28G針頭的1mL注射器于壞死區(qū)周圍給予相應的處理，EPC組給予100μLEPC與PBS混合物，細胞密度為5×106;對照組給予100μLEPB。動物繼續(xù)飼養(yǎng)3個月。

1.5血管密度檢測

抗大鼠α-actin單克隆抗體購于Santa Cruz Biotechnology公司(美國)。被用來顯色平滑肌細胞，以定量心肌內毛細血管密度。免疫組化采用經(jīng)典的ABC染色法。第二抗體為山羊抗大鼠IgG抗體(Sigma)，顯色劑為HRP(horseradish peroxidase)。觀察單位面積(200倍視野，0.5mm2)微血管數(shù)量，計數(shù)6個高倍視野，用均數(shù)來表示。

1.6統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用χ±s表示，用SAS 6.12軟件系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學差異的界值。

2結果

2.1細胞增殖與鑒定

在細胞培養(yǎng)的第7天，細胞拉長成蜘蛛狀(圖1A);EPCs能吞噬DiI-acLDL(圖1B)，并被FITC-UEA-1染成綠色(圖1C)，雙陽性的細胞即是EPC(圖1D)。

2.2血管密度

α-actin抗體染色陽性的血管見圖1A。EPC組心肌內的血管密度明顯高于對照組(EPC組38.33±6.11、對照組26.05±4.40，圖2)，兩組比較有顯著的統(tǒng)計學差異(t=7.48，P<0.01)。

3討論

最近的研究證實血管發(fā)生是另一種重要方式，即由EPC聚集并分化為成熟的內皮細胞形成血管的過程[3]。以前的證據(jù)和我們的實驗結果均表明，在原有或新生的血管壁內可以發(fā)現(xiàn)移植的、骨髓來源的EPC[4]。目前許多實驗結果證實，EPC因其促血管發(fā)生作用可被應用于多種缺血性疾病的治療[5]。

我們的實驗發(fā)現(xiàn)，EPC治療能改善DCM大鼠的心功能，但EPC在改善EF的同時，縮小了LVEDD，這對DCM的治療來講更為關鍵。原因可能是EPC對于血管新生的作用，表現(xiàn)為心肌內血管密度和局部心肌血流量增加。EPC還可以分泌多種細胞因子，包括VEGF，肝細胞生長因子(HGF)等等[6]，這些因子又可以促進血管新生和趨化EPC歸巢，從而形成一個良性循環(huán)。而單次應用細胞因子會隨時間的延長，生物作用減弱。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)，心肌內移植EPC是治療DCM安全可行的方法。移植EPC能改善心功能，促進血管新生和增加局部心肌血流。EPC移植與單次心肌內注射b-FGF相比，療效更好。

[參考文獻]

[1] Kawamoto A， Tkebuchava T， Yamaguchi J， et al. Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia[J]. Circulation，2003，107(3):461-468.

[2] Werner N， Junk S， Laufs U， et al. Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury[J]. Circ Res，2003，93(2):e17-24.

[3] Zhang S，Ge J，Sun A，et al. Comparison of various kinds of bone marrow stem cells for the repair of infarcted myocardium:single clonally purified non-hematopoietic mesenchymal stem cells serve as a superior source[J]. Cell Biochem，2006，99(4):1132-1147.

[4] Scherberich A，Galli R，Jaquiery C，et al. Three-dimensional perfusion culture of human adipose tissue-derived endothelial and osteoblastic progenitors generates osteogenic constructs with intrinsic vascularization capacity[J]. Stem Cells，2007，25(7):1823-1829.

[5] 李毅，韓雅玲，康建，等. 低氧預刺激對大鼠骨髓源性內皮祖細胞生物學活性的影響[J]. 中國實用內科雜志，2006，26(2):99-101.

[6] Kardami E，Jiang ZS，Jimenez SK，et al. Fibroblast growth factor 2 isoforms and cardiac hypertrophy[J]. Cardiovasc Res，2004，63(3):458 -466.

(收稿日期:2010-03-01)