BRMS1\\HDAC1\\VEGF-C在乳腺癌組織中的表達及意義

[摘要] 目的 探討BRMS1、HDAC1及VEGF-C 蛋白在乳腺癌、乳房纖維瘤及正常乳腺組織的表達及意義。方法 采用免疫組織化學方法隨機檢測60例乳腺癌組織標本BRMS1、HDAC1、VEGF-C蛋白的表達，隨機收集乳房纖維瘤組織及其旁正常乳腺組織各20例作為對照組，結合臨床病理資料分析其臨床意義。結果 BRMS1 在乳腺癌組織中表達率為60%，在乳房纖維瘤組織中表達率為85%，在正常乳腺組織中表達率為95%，乳腺癌組織中的BRMS1的表達明顯低于乳房纖維瘤和正常乳腺組織(P<0.05)。HDAC1在乳腺癌組織中表達率為91.7%，在乳房纖維瘤組織中表達率為55%，在正常乳腺組織中表達45%，HDAC1在乳腺癌組織中的表達明顯高于乳房纖維瘤和正常乳腺組織(P<0.01)，乳腺癌中 VEGF-C的表達58.3%高于乳房纖維瘤25%和正常組織20%(P<0.05)。結論 BRMS1、HDAC1和VEGF-C共同參與了乳腺癌的轉移，聯合檢測BRMS1、HDAC1及VEGF-C的表達有助于判斷其預后。

[關鍵詞] BRMS1; HDAC1; VEGF-C; 乳腺癌; 免疫組織化學

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)09-10-03

Expression and Significance of BRMS1，HDAC1 and VEGF-C in Breast Cancer

XIA Genyu CHEN Bin

Yijishan Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001，China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of breast cancer metastasis suppressor 1(BRMS1)protein，histone deacetylase 1(HDAC1) and vascular endothelial cell growth factor-C(VEGF-C) protein in breast cancer. MethodsThe expression of BRMS1 protein，HDAC1 and VEGF-C was detected by using immunohistochemical technique in 60 cases of breast cancer，20 cases of breast fibroids and 20 cases of adjacent normal breast tissue as control and the clinical significance was analyzed with histopalthological records. ResultsThe positive rate of BRMS1 expression was 60% in breast cancer tissue，85% in breast fibroids and 95% in normal breast tissue，showing the positive rate of BRMS1 in breast cancer was much lower than that in breast fibroids and normal breast tissue(P<0.05). The positive rate of HDAC1 expression was 91.7% in breast cancer，55% breast fibroids and 45% in normal breast tissue，showing the positive rate of HDAC1 in breast cancer was obviously higher than that in breast fibroids and normal breast tissue(P<0.01). The positive rate of VEGF-C expression was 58.3% in breast cancer，25% in breast fibroids and 20% in normal breast tissue(P<0.05). ConclusionBRMS1，HDAC1 and VEGF-C might synergistically promote the metastasis of breast cancer. Therefore，the combined detection of the expression of BRMS1 HDAC1 and VEGF-C may be helpful in the determination of the prognosis of breast cancer.

[Key words]BRMS1; HDAC1; VEGF-C; Breast cancer; Immunohistochemistry

腫瘤轉移抑制基因(BRMS1)是抑制腫瘤轉移和擴散的一個重要的途徑。BRMS1是近年新發現的基因，定位于人染色體11q13.1~13.2，與乳腺癌發生的關系密切，本文采用免疫組化法探討BRMS1的病理特征和轉移的關系，BRMS1表達與組蛋白去乙?；?(HDAC1)、血管內皮生長因子-C(VEGF-C)的相互作用及對乳腺癌轉移過程的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集弋磯山醫院2006年1月～2007年4月病理科乳腺癌臘塊標本60例，均有完整的病理資料，術前均未行放化療、內分泌及生物靶向治療，患者年齡31～79歲，中位年齡50.1歲，其中年齡≥50歲28例，<50歲32例，腫瘤直徑>2cm 39例;腫瘤直徑≤2cm 21例，無淋巴結轉移者20例;有淋巴結轉移者40例;根據TNM分期，I期9例，II期27例，III期21例，IV3例ER陽性32例，ER陰性28例，PR(+)44例，PR(-)16例，Her-2(-)～(+)41例，Her-2(2+)～(3+)19例，隨機收集良性乳房組織經病理證實均為乳房纖維腺瘤20例，隨機收集乳房纖維腺瘤旁0.5cm外的正常乳腺組織20例作為對照。

1.2 標本采集和石蠟切片制備

乳腺癌和乳房纖維腺瘤蠟塊均來自病理科，收集我院門診乳房纖維瘤旁正常乳腺組織(距纖維瘤0.5cm以上)，以10%甲醛固定，石蠟包埋后制成蠟塊，全部蠟塊以4μm連續切片，行常規HE染色，選取形態典型標本行免疫組化染色。

1.3 主要實驗試劑

BRMS1兔抗人單克隆抗體，工作濃度1:100。HDAC1鼠抗人多克隆抗體，即用型。即用型SABC免疫組化染色試劑盒，均購自武漢博士德公司。VEGF-C兔抗人單克隆抗體和DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 制片檢測

正常乳腺組織收集后經福爾馬林液固定，24h內取材，常規脫水、透明、浸蠟、包埋，切片(厚度為4μm)，制作成石蠟切片。免疫組化(SABC法)嚴格按試劑盒說明操作。設陽性對照和陰性對照，以已知的乳腺癌陽性片為陽性對照，以PBS代替一抗的乳腺癌組織免疫組化染色結果為陰性對照。

陽性判定:染色主要位于細胞胞漿或(和)胞核內，陽性表達標準參照Kurose K[1]和李治[2]的報道，根據陽性細胞數和著色深度(與背景著色相對比)計分。先將陽性細胞染色強度評分(a)，無色或基本不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;再按陽性細胞所占的百分比評分(b)，每例隨機計數5個高倍鏡(×400)視野，確定其每個視野的陽性率，取平均數，陽性細胞比例<10%為0分，10%～50%為1分，50%以上為2分。將兩者得分相加，a+b<3分計為陰性，≥3分為陽性。

1.5 統計學處理

實驗資料的統計學處理通過SPSS11.5統計軟件包進行。率的比較采用χ2檢驗，多個率的比較采用R×C表χ2檢驗，兩兩比較采用χ2分割法，相關性分析采用Spearman等級相關分析。P值<0.05時認為兩組之間有差異。P值<0.01有顯著差異。

2 實驗結果

乳腺癌組60例患者均為女性，年齡31～79歲，中位年齡50.1歲。其中<50歲32例，≥50歲28例;腫瘤直徑≤2cm 21例，腫瘤直徑>2cm 39例;無淋巴結轉移20例，有淋巴結轉移 40 例;乳腺癌臨床分期根據國際抗癌協會制定的乳腺癌TNM分期標準，Ⅰ期9例，Ⅱ期27例，Ⅲ期21例，Ⅳ期3例;PR陽性44例，PR陰性16例;ER陽性32例，ER陰性28例;Her-2(-)～(+)41例，Her-2(2+)～(3+)19例。

60例乳腺癌組織標本及乳房纖維瘤、正常乳腺組織BRMS1、 HDAC1、VEGF-C蛋白的表達。見表1～2。

3 討論

3.1 BRMS1在乳腺癌中的表達及臨床意義

腫瘤轉移是癌癥患者死亡的主要原因，在腫瘤轉移過程中除存在原癌基因的激活、抑癌基因的失活、細胞間的黏附異常以及金屬蛋白酶及其抑制劑表達失控外，染色體發生雜和性缺失(LOH)與惡性腫瘤轉移的關系十分密切，乳腺癌轉移抑制基因1(breast cancer metastasis suppressor 1，BRMS1)是2000年賓夕法尼亞州立大學Hershey醫學中心Welch DR研究組發現的一種轉移抑制基因。BRMS1可通過多種途徑發揮抑制腫瘤轉移作用，主要集中在兩方面，一方面BRMS1對胞外基質變化的影響以及癌細胞與胞外基質關系的變化，Samant RS[3]用BRMS1轉染的MDA-MB-435 和 MDA-MB-231乳腺癌細胞仍能繼續生長，把浸潤生長的腫瘤注入無胸腺小鼠乳房組織，顯著減少往肺和局部淋巴結的轉移，并推測BRMS1能恢復細胞間的縫隙連接.BRMS1不上調其他腫瘤轉移抑制基因如NM23，Kai1，KiSS1。另一方面是BRMS1對癌細胞的自身運動能力變化的影響，BRMS1可通過磷脂肌醇途徑調節腫瘤轉移[4]及下調骨橋蛋白(OPN)加強誘導凋亡，抑制乳腺癌的轉移[5]。

本研究通過60例乳腺癌，20例乳房纖維瘤，20例正常乳腺組織，進行BRMS1的蛋白檢測，結果表明，乳腺癌的表達率明顯低于正常乳腺和乳房纖維瘤的表達(P<0.01)，而乳房纖維瘤和正常乳腺組織表達無統計學的差異(P>0.05)，在有淋巴結轉移組顯著低于無淋巴結轉移組，TNM分期Ⅲ+Ⅳ低于Ⅰ+Ⅱ組，ER(+)組表達率低于ER(-)組(P<0.05)，PR(-)組低于PR(+)組(P<0.05)，而與年齡、腫瘤大小和Her-2狀態無關。從表中可以看出，無淋巴結及有淋巴結轉移組差異較為明顯(P<0.05)，可以推測BRMS1的缺失是造成乳腺癌轉移的因素之一，與乳腺癌的侵襲和轉移相關，尤其與乳腺癌的淋巴結轉移密切相關，BRMS1可作為乳腺癌預后的一個獨立指標。防止BRMS1的缺失，提高其在乳腺癌的表達是預防乳腺癌發病和治療乳腺癌的一種手段，BRMS1可調控多個基因抑制腫瘤轉移，但要準確判斷是否有轉移，還要結合其他相關指標及是否與其他生物學指標有相互作用。

3.2 HDAC1在乳腺癌中的表達及臨床意義

組蛋白去乙?；?脫乙酰化酶與基因轉錄的調控有密切的關系。HDAC1既可直接抑制基因轉錄，又與轉錄共抑制子mSin3、Rb等相互作用介導他們的功能[6]。HDAC1作為一種基因調控因子，在乳腺惡性腫瘤中可能抑制ER的表達[7]。HDAC1拮抗劑是抗乳腺癌的新途徑[8]。HDAC1拮抗劑功能的一個方面是HDAC1參與組成的多蛋白復合體完整性受損從而影響該多蛋白復合體的功能，使其甲基化功能受損。同時HDAC1表達減少可通過pZI和Bd-2的ax這一通路引起細胞凋亡增多和細胞周期受阻而使增殖減少。

統計學結果顯示，HDAC1蛋白在乳腺癌表達率是91.7%，乳房纖維瘤蛋白表達率是55%，正常乳腺組織表達率是45%，HDAC1在乳腺癌表達明顯高于乳房纖維瘤和正常乳腺組織(P<0.01)，HDAC1在乳房纖維瘤和正常乳腺組織的表達無統計學意義(P>0.05)。HDAC1的表達與淋巴結轉移、TNM分期、ER的表達相關(P<0.05)，與年齡，腫瘤大小、PR、Her-2受體狀態無相關性(P>0.05)。值得注意的是淋巴結轉移和TNM分期與乳腺癌的侵襲和轉移密切相關，兩者均有顯著差異(P<0.01)，HDAC1陽性常提示乳腺癌預后不良，因此HDAC1是乳腺浸潤和轉移的一個因素，與乳腺癌發病及轉移相關，是乳腺癌預后的一個指標。

3.3 VEGF-C在乳腺癌中表達及臨床意義

VEGF-C是VEGF的新成員，又稱淋巴管生長因子，腫瘤細胞通過合成VEGF-C誘導內皮細胞生長并形成新的淋巴管，在乳腺癌淋巴結轉移中有重要作用。VEGF-C能改變淋巴管內皮的黏附特性，影響其分泌的細胞因子和趨化因子[9]。但VEGF-C 不能誘導自發的淋巴管生成，其發揮作用依賴于原有的淋巴系統，它可以是誘導孤立的淋巴島連接成網，也可以是以發出絲狀偽足的方式萌芽[10]。

本研究顯示:VEGF-C在乳腺癌表達的陽性率是58.3%，纖維瘤陽性率是25%，正常乳腺組織是20%，差異有統計學意義(P<0.01)，VEGF-C在乳腺癌表達率與乳房纖維瘤相比較，有統計學意義(P<0.05)，乳腺癌與正常乳腺組織比較，有顯著差異(P<0.01)，乳房纖維瘤和正常乳腺組織VEGF-C的表達無顯著的區別(P>0.05)，VEGF-C表達在有淋巴結轉移和無淋巴結轉移組有顯著性差異(P<0.01)，與乳腺癌的淋巴結轉移密切相關，而與腫瘤大小、年齡、ER、PR、TNM分期及Her-2受體狀態無關(P>0.05)。提示VEGF-C可能參與乳腺癌的侵襲和轉移，與乳腺癌轉移和預后相關，尤其與淋巴結轉移密切相關，因此VEGF-C可作為預后的指標，抑制VEGF-C在乳腺癌組織的表達是防治乳腺癌的一個有效的途徑。

3.4 BRMS1、HDAC1與VEGF-C的相關性及可能存在的作用機制

Spearman等級相關分析表明，乳腺癌中BRMS1與HDAC1呈負相關(r =-0.406，P<0.01)，BRMS1的表達與VEGF-C的表達呈負相關(r =-0.262，P<0.05)，HDAC1的表達與VEGF-C的表達呈正相關(r =0.312，P<0.05)，這說明三者可能共同參與了乳腺的侵襲和轉移，而且存在著相互作用機制，BRMS1使HDAC1下調，HDAC1能上調VEGF-c，產生血管和淋巴管，產生淋巴管通過與VEGFR-3結合，通過多種途徑，最終在細胞外基質成分及淋巴管內皮細胞周圍形成新生淋巴管。

綜上所述，我們的實驗結果是在乳腺癌中可能存在這樣的一條通路:BRMS1可下調HDAC1的表達，使VEGF-C的表達減少，從而達到抑制腫瘤的轉移，我們針對BRMS1的轉移機制進行靶向治療，可抑制乳腺癌的轉移，延長生命，改善生存質量及預后，為我們防癌抗癌提供了一個新的途徑。

[參考文獻]

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(收稿日期:2009-11-12)