端粒酶、VEGF基因蛋白在食管癌中的表達及臨床意義

李 牧，宋劍非，梁岳培，鄭 民，李安桂，王 瑋

(桂林醫學院附屬醫院心胸外科，廣西 桂林 541001)

食管癌在中國的發生率較高，在消化道腫瘤中僅次于胃癌，其發病率男為 2.5/100000～5.0/100000，女為 1.5/100000～2.5/100000。雖然食管癌發生、發展的危險因素已被確認，但其分子機制仍在研究中。盡管現代診斷技術不斷提高，但食管癌的早期診斷仍不樂觀。食管癌的發生、發展是一個多基因參與、多步驟的過程，隨著分子生物學的發展，基因及其產物的表達與腫瘤的關系成為食管癌防治的重點。本研究分析了端粒酶、血管內皮細胞生長因子(vascular endothelialgrow th factor，VEGF)在食管癌中的表達情況，探討其與臨床病理的關系以及他們的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選擇桂林醫學院附屬醫院2002年1月12日至2008年5月17日食管癌根治術后石蠟包埋組織100例。男 69例，女 31例，年齡42～75歲，平均(59±6)歲。標本均經病理學確診為鱗狀細胞癌。其中有淋巴結轉移者57例(指手術清掃的鎖骨上、食管旁或肺門淋巴結組織經病理鏡檢診斷為陽性的病例)，無淋巴結轉移者43例;高分化鱗癌32例，中分化鱗癌51例，低分化鱗癌17例;侵及外膜的 67例，未侵及外膜的33例。所有患者送病理檢查前均未放療和化療，有完整的臨床和病歷資料。另取癌旁正常食管黏膜組織標本41例(指癌組織切緣旁組織，經病理診斷為正常黏膜組織，無腫瘤組織殘留的標本)作為正常對照組。

1.2 試劑來源 采用免疫組化SP法，鼠抗人端粒酶單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、SP試劑盒、DAB顯色劑均購自福州邁新公司(即用型)。PBS溶液、檸檬酸修復液、抗體稀釋液、梯度乙醇等均由桂林醫學院附屬醫院病理科提供。

1.3 方法 全部石蠟標本連續切片，厚度為4μm，免疫組化染色采用SP法，所有標本均在同一條件下嚴格按試劑盒說明書操作，DAB顯色，以已知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗進行陰性對照。

1.4 染色結果評定 結果判斷標準:食管黏膜鱗狀上皮細胞核、食管癌細胞核和(或)細胞質染成棕褐色為端粒酶陽性染色，每例陽性染色的癌細胞大于10%為陽性表達。細胞VEGF蛋白陽性表達定位于細胞漿中，呈棕黃色顆粒;部分腫瘤細胞細胞膜也有染色;在強陽性染色的癌組織附件可見淋巴管內皮著色。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件對數據進行分析，各組之間樣本率的比較采用χ2檢驗，各指標相關分析采用Spearman等級相關。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 食管癌和癌旁組織端粒酶、VEGF蛋白的表達情況 陽性染色特點:端粒酶蛋白在85例食管癌腫瘤細胞及5例癌旁黏膜細胞有表達，陽性表達定位于食管黏膜鱗狀上皮細胞核和食管癌細胞質和(或)細胞膜核，呈棕褐色。VEGF蛋白在81例食管癌腫瘤細胞及7例癌旁黏膜細胞有表達，陽性表達定位于細胞漿中，呈棕黃色顆粒;部分腫瘤細胞細胞膜也有染色，見表1。

表1 端粒酶、VEGF在正常食管黏膜和組織食管鱗狀細胞癌中的表達

2.2 食管癌組織端粒酶和VEGF蛋白的表達與臨床病理特征的關系 食管癌組織端粒酶、VEGF蛋白的表達:(1)在不同性別、年齡及腫瘤的大小差異無統計學意義(P＞0.05);(2)與淋巴結轉移、臨床分期以及腫瘤浸潤深度顯著相關，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 端粒酶、VEGF的蛋白表達與臨床病理參數的關系

2.3 端粒酶、VEGF蛋白表達間的相關性 應用端粒酶相關分析表明，端粒酶與VEGF蛋白表達存在正相關關系，相關系數(r=0.436，P＜0.05)，見表2。

3 討 論

端粒酶是一種獨特的核糖核蛋白酶，能夠以自身為模板合成端粒，維持端粒穩定，阻止細胞凋亡甚至導致腫瘤發生。端粒酶活性使端粒長度保持穩定的狀態，使細胞獲得無限增殖的能力。它的活性是在染色體末端不斷添加端粒DNA重復序列，阻止端粒的丟失，使細胞無限增殖而被永生化，而永生化又被認為是腫瘤惡化的必要步驟，因此，端粒酶在人類細胞永生和致癌過程中起著至關重要的作用[1]。除了少數增殖旺盛的細胞(如生殖細胞、淋巴細胞)有微弱的端粒酶活性外，其他正常細胞和組織無端粒酶活性表達[2]。因此，很多學者認為端粒酶活性是可靠的腫瘤標記物[3]。本研究所取100例食管癌標本中，端粒酶在食管癌中有高表達，正常食管黏膜組織端粒酶活性表達較低，提示其在食管癌的發生、發展過程中起重要作用。與王國磊等[4]報道基本一致。且與癌的浸潤深度有一定的相關性，其表達率隨浸潤程度的增加而增高，從而說明端粒酶與惡性腫瘤有密切關系。本研究發現，端粒酶活性與臨床分期、腫瘤浸潤深度和淋巴結轉移顯著相關，說明端粒酶對食管癌發展和預后起重要作用，這與多數文獻的報道基本一致[5]。

通過檢測腫瘤切緣某些分子標記物可發現局部的隱匿性癌灶，準確判斷腫瘤浸潤的邊界，也就是“腫瘤分子定界”，彌補了傳統從細胞形態定界的不足。由于端粒酶的活化，使端粒的長度處于一種失動態平衡，而使細胞獲得無限增殖的能力，導致腫瘤的發生。端粒酶在食管癌組織中的高表達，為臨床診斷提供了分子學依據，同時也為以端粒酶做靶點的食管癌的基因治療提供了理論依據。本實驗中，有淋巴結轉移食管癌組織中陽性率為83.6%(46/55)，明顯高于無淋巴結轉移食管癌組織的57.1%(16/28)。隨著腫瘤浸潤深度增加，端粒酶陽性率呈升高趨勢，可見端粒酶活性檢測對食管癌患者的預后判斷有一定價值[6]。

VEGF是最重要的血管源性生長因子，它可直接作用于血管內皮細胞，刺激其有絲分裂的發生，從而促進新生血管的生長，并可通過增加血管的通透性，為血管內皮細胞的遷移及腫瘤細胞的轉移提供基質。本研究中VEGF的表達量，在正常食管黏膜中明顯低于癌組織中，并且在癌組織的表達集中于腫瘤浸潤的前緣，說明食管癌的浸潤與VEGF的高表達密切相關。進一步分析顯示，VEGF的表達量與淋巴結轉移浸潤有關，有淋巴結轉移組的VEGF表達量明顯高于無淋巴結轉移組，說明VEGF的表達與食管癌的淋巴轉移密切相關。且與癌的浸潤程度有一定的相關性，其表達率隨浸潤程度的增加而增高。

新血管形成是保證腫瘤生長和轉移的組織學基礎，受多種促血管因子和抗血管生成因子的雙重調節。VEGF是目前已知作用最強的促血管形成因子之一，也是腫瘤細胞分泌的血管形成因子中最重要的一種，其過度表達與許多惡性腫瘤的不良預后有關。據報道，食管鱗癌陽性率為23.9%～93.3%，本研究為81.0%。VEGF主要表達于癌細胞，具有明顯的異質性，強陽性表達的細胞多位于浸潤前緣，在血管內皮不表達或極少量表達，與Mbius等[7]的報道相似。推測VEGF主要以旁分泌途徑作用于血管內皮細胞。近年研究還發現，VEGF可能與腫瘤淋巴結轉移相關[8]，有淋巴結轉移組的VEGF表達量明顯高于無淋巴結轉移組。其可能機制為:通過促進新生血管形成而促進腫瘤生長，并使癌細胞通過靜脈-淋巴管吻合處從血液進入淋巴管的概率增加;VEGF是高度特異的血管內皮細胞有絲分裂原，是腫瘤新生血管生成的重要調控因子，不僅參與腫瘤血管生成、增殖，還直接與腫瘤浸潤轉移有關，且其表達水平與腫瘤的惡性程度有關[9]。VEGF與食管鱗狀細胞癌的浸潤程度、淋巴結轉移呈正相關。因此，可以作為判定食管癌生物學行為的檢測及預后指標。本研究顯示，VEGF在食管癌中的表達與癌旁非典型增生組織及正常食管黏膜組織比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。提示VEGF可誘導食管癌腫瘤血管形成，提高其通透性，促使腫瘤細胞浸潤轉移、惡性程度增加。VEGF可直接作用于血管內皮細胞，刺激其有絲分裂的發生，從而促進新生血管的生長，并可通過增加血管的通透性，為血管內皮細胞的遷移及腫瘤細胞的轉移提供基質。

端粒酶和VEGF基因蛋白在正常食管黏膜組織中表達均陰性，而在食管癌組織中有不同程度的陽性表達，說明它們都參與了食管癌的發生、發展過程，證明食管癌的發生是多種基因作用的結果。端粒酶和VEGF基因蛋白隨病程的進展，其表達量逐漸增加，兩者之間有協同作用，它們以不同的機制促進了食管癌的發生、發展、侵襲和轉移。它們可作為惡性腫瘤檢測的特異性標記物，對食管癌患者進行端粒酶和VEGF的聯合檢測，可作為食管癌的早期診斷和評估其預后的重要分子生物學指標。判斷食管癌的侵襲和轉移能力，為術后高危患者制訂合理的治療方案及防止腫瘤的復發和轉移提供可靠的依據。

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