CK19 m RNA在45例乳腺癌患者外周血中的表達*

莫軍揚，黃 平，莊亞強，梁志東，向川江

(廣西醫科大學第五附屬醫院乳腺外科，廣西 柳州 545006)

CK 19 m RNA是上皮組織來源的組織特異性標志物，其表達與乳腺癌微轉移和療效密切相關[1]。外周血是腫瘤發生遠處轉移的必經途徑。但是目前仍然不清楚乳腺癌發生、發展和浸潤轉移的具體分子機制，如果在早期能找到其浸潤轉移的指標，對于指導治療、提高術后生存率有重要的意義。正常人外周血中無上皮細胞及上皮源性細胞，如果從癌癥患者外周血中檢出上皮源性細胞，則說明癌細胞已轉移入外周血。本研究采用逆轉錄多聚酶鏈反應(reverse transcription polymerase chainreactio，RT-PC R)法檢測乳腺癌外周血中CK 19 m RNA的表達，結合臨床病理因素(腫瘤大小、淋巴結轉移狀況、臨床分期等)，分析它們之間的相關性及其臨床意義，以期建立可靠的乳腺癌微轉移的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 45例乳腺癌組織均取自2006年6月至2008年11月廣西柳州市人民醫院乳腺外科住院患者，均為首次手術或空芯針穿刺診斷且未經治療的原發乳腺癌標本，病理診斷明確，均為女性。HE切片，病理分型、TNM 分期參考《中國腫瘤病理學分類》，其中 TNM 分期分為Ⅰ期 10例，Ⅱ期18例，Ⅲ期17例;無淋巴結轉移 15例，有淋巴結轉移30例;病理類型:浸潤性導管癌36例，黏液癌3例，導管內癌6例。乳腺良性病變患者30例，其中乳腺纖維腺瘤20例，乳腺囊性增生病8例，導管內乳頭狀瘤2例。年齡19～81歲，平均45歲。術前胸部X線、B超、CT及MRI全身彌散等檢查未發現遠處轉移灶。

1.2 主要試劑和儀器 RT-PCR檢測CK19 m RNA試劑盒(廣州達暉生物技術有限公司)和5700型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。CK19 m RNA 的上游引物:5′-CAG GTC AGT GGA GGT GGA T-3′，下 游 引物:5′-TTC GCA TGT CAC TCA GGA TC T T-3′;cDNA模板對照:β2微球蛋白的cDNA;陽性對照:乳腺癌細胞系MCF-7的cDNA;陰性對照:人纖維肉瘤細胞系HT 1080;假基因擴增對照:乳腺癌細胞系MCF-7的基因組DNA。

1.3 RT-PCR法檢測CK19 m RNA水平 (1)抽提總RNA。抽取每例乳腺癌患者治療前外周靜脈血5 m L，均為肝素抗凝。留取血清檢測CK19 m RNA。用試劑盒提供的RNA提取液提取RNA。測A 260～280處吸光值，并計算RNA含量。操作過程嚴格無菌技術以避免污染。(2)逆轉錄反應。制作CK 19 m RNA基因標志物的標準品濃度。原標準品濃度為109拷貝/m L，稀釋濃度后分別為4×108、4×107、4×106、4×105拷貝/m L。配制混合液，每個反應需RT反應液18μL，鼠白血病病毒(M-M LV)逆轉錄酶 1μL，RNA 酶 1 u，共20μL，分別加入5μL的預變性 RNA、4種濃度標準品、陽性及陰性對照，混勻離心，37℃水浴 60 min。(3)RT-PCR測定。配制PCR反應混合液，每個反應所需 PCR反應液43μL，Taq E 2μL，共計45μL。取45μL反應液分別裝入PCR小管中，取 45μL RT反應物加入上述管中，混勻離心，放入PC R檢測儀。每次檢測均同法加入不同濃度的標準品、陽性及陰性對照。反應程序如下:預變性 93 ℃、2 min;93 ℃、45 s，55 ℃、60 s，共 40個循環;延伸72℃、10 min。記錄結果。反應結束后分析實驗數據，儀器自動得出未知標本數值M。將最終計算結果按下列公式換算:A(拷貝數/μg總 RNA)=B(拷貝數/μg cDNA)÷ 樣本RNA的OD260值×5/6。

1.4 結果判斷 用 RT-PCR檢測CK19 m RNA的表達時，在實驗中用人纖維肉瘤細胞系HT 1080的cDNA作為陰性對照，用乳腺癌細胞系MCF-7 cDNA作為陽性對照，用乳腺癌細胞系MCF-7的基因組DNA作為假基因擴增對照。結果顯示陰性對照和假基因擴增對照均無擴增條帶，而陽性對照有擴增條帶。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件對數據進行χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CK19 m RNA在乳腺癌患者外周血中表達 在乳腺癌患者外周血中，CK 19 m RNA陽性率為62.2%;乳腺癌患者與乳腺良性病變患者陽性率比較差異有統計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 外周血中CK19 m RNA表達的檢測結果

2.2 CK19 m RNA與乳腺癌病理特征及臨床分期關系 隨著臨床分期的增加，CK19 m RNA陽性率呈逐漸增加趨勢。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌患者CK 19 m RNA陽性率分別為 30.0%、61.1%、82.4%，各期間比較差異有統計學意義(P＜0.01)。有淋巴結轉移者陽性率達83.3%，有淋巴結轉移患者的陽性率顯著高于無轉移者，二者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。CEA m RNA陽性率與臨床分期、淋巴結轉移相關(P＜0.01)，與腫物大小、ER、PR表達無關(P＞0.05)，見表2。

表2 CK 19 m RNA在乳腺癌組織中的表達情況及關系

表2 (續) CK19 m RNA在乳腺癌組織中的表達情況及關系

3 討 論

自1869年Ashworth在外周血中發現癌細胞以來，腫瘤微轉移的概念便在臨床中建立起來，并逐漸成為研究熱點之一。血行轉移是乳腺癌轉移的主要途徑之一，如果能在亞臨床階段檢測到微小轉移灶，則對腫瘤的分期、治療和預后有重要意義。Pretlow等[2]將從有遠處轉移的前列腺癌患者外周血中獲得的癌細胞注入裸鼠體內，結果在部分肺內形成了轉移灶，因此，循環血液中檢測出癌細胞，在一定程度上表明腫瘤具有較強的轉移傾向，有助于臨床的分期和治療方案的選擇。隨著分子生物技術的發展，尤其RT-PC R技術的成熟和完善，被認為是目前檢測外周血微轉移的有效方法。

CK19 m RNA是上皮組織來源的組織特異性標志物，是一相對分子質量為40×103的酸性蛋白質，為上皮細胞骨架的一部分，在惡性上皮細胞中，激活的蛋白酶加速了細胞角蛋白降解，使得大量片段入血，CK19 m RNA在乳腺癌發生早期即上升，且與療效、腫瘤轉移密切相關，因此，其表達與乳腺癌微轉移和療效密切相關[3]。作為上皮來源腫瘤，表達于上皮來源性細胞生物學特征的CK19 m RNA在間葉組織來源的血液中無表達，基于這一特性，利用 RT-PC R技術檢測血液中CK 19 m RNA可以判斷是否存在微轉移。因此，在淋巴結、骨髓和外周血中查獲上皮膜抗原和角蛋白的表達陽性，可以認為是乳腺癌診斷及微轉移的指標[4]。茹景順等[5]研究發現如果淋巴結常規檢查為陰性，可作淋巴結的CK19免疫組化檢測，可提高淋巴結轉移灶的檢出率。陸云飛等[6]研究提示用乳腺癌特異性上皮細胞產物，如CK、EM A等進行免疫組化染色能發現常規病理檢查不能檢測到的微轉移，而RT-PCR檢測敏感性更高。Parikh等[7]研究發現其表達缺失和乳腺癌的局部復發明顯相關，也與遠處的轉移及總生存率有關。王梅和葛明建[8]研究也發現術后CK19 m RNA的表達水平增加與腫瘤術后復發有一定關系，并且認為局部控制好壞與分子水平緩解密切相關。

本研究結果顯示CK 19 m RNA陽性率為62.2%，本實驗發現30例乳腺良性病變患者中有1例CK 19 m RNA表達陽性，可能原因為:(1)RT-PCR靈敏度高，存在假陽性可能;(2)有癌前病變可能。淋巴結轉移者和無淋巴結轉移者CK 19 m RNA陽性率分別為83.3%、53.3%，二者比較差異有統計學意義。表明RT-PCR技術能檢出常規病理檢查不能發現的微轉移灶，可顯著提高對乳腺癌外周血轉移診斷的敏感度及準確率。

乳腺癌患者外周血CK 19 m RNA的水平在各TNM分組的差異有統計學意義(P＜0.01)，并隨著臨床分期的遞增，CK 19 m RNA的水平及陽性檢出率逐漸升高，提示患者發生腫瘤細胞血行播散的危險隨著臨床分期的遞增有增加的趨勢。本研究結果顯示，Ⅱ、Ⅲ期患者CK19 m RNA的表達水平高于Ⅰ期患者，各分期間比較差異有統計學意義，與Wong等[9]的報道一致。提示CK19 m RNA的表達與乳腺癌的生物學行為及惡性程度有關，CK 19 m RNA的檢測將有助于評估乳腺癌患者的預后。

本實驗結果顯示CK19 m RNA在乳腺癌外周血中陽性率僅為62.2%，對此可能的解釋有:(1)可能與腫瘤細胞呈間歇性釋放入血有關[10];(2)由于腫瘤在基因表達上具有異質性，加上微循環的某種因素，血循環中腫瘤細胞也許不表達該基因，有別于組織標本[11];(3)標志物的特異性或檢測的方法的敏感性有待提高。因此，可采用多次采血、多種腫瘤標志基因等檢測方法以提高檢測陽性率。

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