COX-2特異性的siRNA誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡*

譙 敏，向廷秀，王丕龍

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 400016)

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)合成前列腺素(prostaglandins，PGs)的限速酶，包括COX-1與COX-2兩種同工酶。其中COX-2是由Xie等在1991年發(fā)現(xiàn)的一種誘導型酶，在正常生理狀態(tài)下COX-2幾乎不表達，而在多種惡性腫瘤細胞及組織中呈高表達狀態(tài)[1-4]。RNA干擾(RNA interfering，RNAi)是指雙鏈 RNA引發(fā)細胞漿內(nèi)同源m RNA降解的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-troanseriptional gene silence，PTGS)現(xiàn)象，具有特異、高效、可傳遞等優(yōu)點[5-9]。本實驗利用轉(zhuǎn)錄載體p TZU 6+1構(gòu)建COX-2的短發(fā)夾狀RNA(smallhairpin RNA，siRNA)，研究其對胃癌細胞株SGC-7901中COX-2基因的抑制作用，進一步了解RNAi介導的SGC-7901細胞凋亡及其可能的作用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒p TZU 6+1為重慶醫(yī)科大學感染性疾病分子生物學重點實驗室黃愛龍教授惠贈。限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、SalⅡ、HindⅢ和Eco RⅠ購自 Taka Ra公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、連接試劑盒、總RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000和末端標記細胞凋亡檢測法(T UNEL)反應(yīng)試劑盒等分別購自 Taka Ra、Promega、Omiga和Invitrogen公司等。COX-2、Caspase-3和 Caspase-9的兔抗人多抗均為美國Santa C rutz公司產(chǎn)品;HRP標記的羊抗兔IgG(二抗)購自北京中山生物技術(shù)公司。COX-2引物和內(nèi)參GAPDH引物以及siRNA轉(zhuǎn)錄模板由北京三博遠志生物工程技術(shù)有限服務(wù)公司和大連寶生物公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng) 胃癌SGC-7901細胞株由重慶醫(yī)科大學病理教研室提供。在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 siRNA結(jié)構(gòu)的設(shè)計和合成 根據(jù)siRNA設(shè)計原則[10]和COX-2編碼序列，設(shè)計19個堿基的 DNA片段，中間為 8個與目的基因無同源性的插入序列(GAGTACTG)，末端終止子TT TTT，并利用BLAST進行查詢，確定其為特異性序列，合成的重組質(zhì)粒命名為p TZU 6+1-siRNA-COX-2。共設(shè)計、合成2對COX-2編碼序列的反向重復序列以及2對對應(yīng)的點突變反向重復序列。合成的DNA兩端設(shè)計有XhoⅠ或XbaⅠ酶切位點，便于與p TZU 6+1載體連接。siRNA的轉(zhuǎn)錄模板序列的正義鏈分別為:5′-AAC TGC TCA ACA CCG GAA T-3′和 5′-GCC TTC TCT AAC CTC TCC T-3′。 對應(yīng)的點突變序列的正義鏈分別為:5′-AAC TGC TCT ACA CCG GAA T-3′合 5′-GCC TTC TCA AAC CTC TCC T-3′。

1.4 重組載體siRNA的構(gòu)建 內(nèi)切酶SalⅠ和XbaⅠ酶切轉(zhuǎn)錄載體p TZU6+1，凝膠電泳檢查證實載體酶切完全。將其與純化的雙鏈DNA片段在T 4DNA連接酶作用下，4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109，Amp抗性篩選。篩選克隆提取DNA，用EcoRⅠ和 HindⅢ分別酶切，并用相同的酶酶切載體p TZU 6+1作為對照，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將篩選的重組質(zhì)粒測序確定，以證實目的DNA片段克隆入p TZU 6+1載體，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為p TZU 6+1-siRNA-COX-2，對應(yīng)目的序列及相應(yīng)的點突變序列構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別簡稱為pC1-siRNA 、p C2-siRNA 、p C1′-siRNA 和 pC2′-siRNA 。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 按照Invitrogen公司lipofectamine 2000的說明書進行轉(zhuǎn)染。將正常培養(yǎng)的SGC-7901細胞用胰酶消化、離心、棄上清液，沉淀用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整濃度為4×105cells/m L，以2 m L細胞接種于 6孔培養(yǎng)板中，置37℃培養(yǎng)。待細胞生長到占培養(yǎng)瓶底約70%～80%時，換為無抗菌素含血清的RPM I-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)過夜。次日，分別用pC1-siRNA 、p C2-siRNA 、p C1′-siRNA 和 pC2′-siRNA 轉(zhuǎn) 染 SGC-7901細胞，同時設(shè) p TZU6+1空載體轉(zhuǎn)染的陰性對照，在無血清、無抗菌藥物的培養(yǎng)液中培養(yǎng)4～6 h后換新鮮10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后檢測各指標。

1.6 免疫細胞化學檢測COX-2蛋白表達的變化 收獲細胞，用95%乙醇固定后，按COX-2抗體說明書(SABC法)進行操作。DAB顯色，二甲苯透明，封片并照相。采用軟件Image Proc Plus3.0(IPP3.0)進行分析。

1.7 T UNEL檢測細胞凋亡 采用TUNEL反應(yīng)試劑盒。取對數(shù)生長期的SGC-7901細胞4×105接種于6孔板，含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，分組轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染后72 h，棄上清液，用 95%乙醇固定，3%H2O2封閉，0.1%Triton-100，每孔加50μL反應(yīng)混合液，37℃孵育 60 min，每孔加50 m L POD，最后用DAB顯色。

1.8 Western Blot檢測Caspase-9和Caspase-3蛋白表達配制10%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠。分別收集陰性對照組和轉(zhuǎn)染 pC1-siRNA、p C2-siRNA、pC1′-siRNA和pC2′-siRNA質(zhì)粒72 h的SGC-7901細胞，沉淀用PBS洗2遍，細菌裂解液處理，上樣10μL，90 V恒壓電泳約60 min，120 V恒壓電泳約2 h。電泳完畢后取出凝膠，4℃、25 V恒壓電轉(zhuǎn)過夜。次晨取出 NC膜，加1∶500稀釋的 Caspase-9和Caspase-3一抗溶液，4℃過夜，加1∶1000的辣根過氧化物酶標記稀釋二抗溶液，37℃、輕輕振蕩2 h后棄反應(yīng)液，用DAB染色試劑盒染色，BIO-RAD圖像分析儀上觀察并掃描制片，記錄結(jié)果。采用軟件Image Proc Plus3.0(IPP 3.0)進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建與鑒定 p C1-siRNA、pC2-siRNA、pC1′-siRNA 和 p C2′-siRNA 質(zhì) 粒 經(jīng) Hind Ⅲ 和 Eco RⅠ 雙酶切，同時做p TZU6+1空載體雙酶切對照。瓊脂糖電泳，p TZU6+1空載經(jīng)雙酶切后呈2條帶，分別為2.8 kb的載體片段和350 bp左右的小片段;而重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后則為2.8 kb的載體片段和400 bp左右的條帶(圖1)。測序結(jié)果也證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，插入DNA序列均正確。

2.2 免疫細胞化學檢測結(jié)果 對照組質(zhì)粒、p C1′-siRNA和pC2′-siRNA質(zhì)粒處理的 SGC-7901細胞可見細胞漿黃染，內(nèi)有較多棕黃色顆粒為陽性。而經(jīng)pC1-siRNA和pC2-siRNA處理的胃癌SGC-7901細胞，細胞漿的黃色明顯減弱、變淺，說明COX-2蛋白表達低于對照組(圖2)。

2.3 Western Blot檢測結(jié)果 以β-actin蛋白條帶的強弱作為標準，與對照組比較，pC1-siRNA和p C2-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞Caspase-9和 Caspase-3表達明顯增強，而 pC1′-siRNA和pC2′-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞中 Caspase-9和Caspase-3蛋白表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(圖3)。

圖1 重組質(zhì)粒p TZU6+1-siRNA-COX-2的酶切鑒定

圖2 免疫細胞化學檢測COX-2蛋白表達

圖3 Western Blot檢測SGC-7901細胞中Caspases蛋白的表達

2.4 TUNEL檢測結(jié)果 TUNEL染色反應(yīng)后，在倒置顯微鏡下可見 ，對照組 、轉(zhuǎn)染 pC1′-siRNA 和p C2′-siRNA 組 細胞大部分貼壁良好，形態(tài)完整正常，少量胞核內(nèi)有著色現(xiàn)象，胞質(zhì)著色淺。在轉(zhuǎn)染p C1-siRNA和p C2-siRNA的SGC-7901細胞中出現(xiàn)大量凋亡細胞(P＜0.05)，表現(xiàn)為細胞核中央呈類圓形、均一的棕色，在胞漿中有片狀著色，核濃縮，凋亡小體形成(圖 4)。

圖4 T UNEL檢測SGC-7901細胞凋亡

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，COX-2不僅是啟動炎性反應(yīng)的關(guān)鍵酶，還可以通過促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡、促進腫瘤新生血管形成等機制促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，其具有高發(fā)病率、高惡性度、預后不良的特點，臨床手術(shù)切除后常需進行輔助性化療，其目的在于抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡。研究表明，在胃癌組織和細胞中，COX-2常呈高表達狀態(tài)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關(guān)。RNAi是一種PTGS的基因阻斷技術(shù)，近年來被廣泛應(yīng)用于哺乳動物細胞抑制基因表達[11-12]。本課題通過構(gòu)建重組質(zhì)粒，將siRNA導入胃癌SGC-7901細胞內(nèi)誘發(fā) RNAi，進而觀察 COX-2表達變化、SGC-7901細胞凋亡及與凋亡相關(guān)的信號分子改變。

作者構(gòu)建了2對COX-2編碼序列的反向重復序列以及2對對應(yīng)的點突變反向重復序列，即p C1-siRNA、pC2-siRNA、pC1′-siRNA 和 pC2′-siRNA ，并用 其轉(zhuǎn) 染胃 癌 SGC-7901 細 胞株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)p C1-siRNA和pC2-siRNA均能顯著下調(diào)SGC-7901細胞中 COX-2表達，而pC1′-siRNA 和p C2′-siRNA 處理的SGC-7901中COX-2表達無明顯改變。說明RNAi對同源m RNA的作用是很特異的，即使發(fā)生堿基的點突變也可能影響RNAi的效力。這與 Phipps等[13]和 Elbashir等[14]的報道相一致。本實驗中，作者還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pC1-siRNA和pC2-siRNA的SGC-7901出現(xiàn)明顯的細胞凋亡，且與對照組相比，Caspase-9和Caspase-3表達明顯上調(diào)，說明COX-2基因特異性的siRNA可能通過激活Caspases通路而誘發(fā)SGC-7901細胞凋亡。

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