結腸癌組織中Toll樣受體4基因表達

黃宏耀 陳巍巍 張秋瑩 劉方方 鄧 濤 謝圣高

腫 瘤細胞表面存在 Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR),它有 10余個家族成員,屬于 I型跨膜蛋白,可通過識別相關病原的分子模式及某些內源性配體引發信號傳導和炎癥介質釋放。研究證實Toll樣受體4(TLR-4)可介導腫瘤細胞的免疫逃逸和浸潤功能。本文應用實時熒光定量PCR(Realtime PCR)檢測結腸癌及癌旁組織中TLR-4 mRNA水平,為TLR-4基因表達與結腸癌發生、發展、浸潤、轉移的關系研究提供資料。

1 資料與方法

1.1 材料

63例結腸癌組織及其癌旁正常組織(距離肉眼可見的癌組織≥2cm以上取材)組織標本來自本院2006年2月至2009年3月間結腸癌手術患者,均經組織病理學確診,癌旁正常組織經過病理檢測無癌細胞浸潤,病例均未經過放、化療,其中男女性各為37、26例,有無淋巴結轉移各為 27、36例,高、中、低分化各為 23、17、20 例;Dukes'A 、B、C、D 期各為 18、14、22、9 例。

1.2 試劑與儀器

TLR-4引物:上游:5'-AGCCACCTCTCTACCTTAATATTGA-3',下游:3'-CCGAGTGTTA GAATAG GTTAGAAA G-5',Prism?7900型熒光定量 PCR儀(ABI,美國),Trizol Reagent(Invitrogen,美國),反轉錄試劑盒(TOYOBO,日本),熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI,美國)。

1.3 cDNA制備和熒光定量PCR方法

所有結腸癌組織和癌旁正常組織均分別按照 Trizol試劑說明書提取總RNA,然后根據反轉錄試劑說明將總RNA逆轉錄成cDNA。Realtime PCR體系為25μl,按照下列順序依次加入反轉錄產物、上游引物、下游引物各、熒光染料共12.5μl至 EP管中,補水至總體積25μl,同時制作標準品曲線。PCR反應程序為 95℃變性 5 min,94℃、60℃、72℃各20s,55個循環后,72℃保溫5 min,55℃10s。每樣本設置3個平行孔,取拷貝數均值進行統計分析。

1.4 統計學處理

各組Realtime PCR結果根據標準曲線讀取,以絕對定量數值表示,用SPSS 12.0統計軟件得出均數±標準差(±s),組間差異比較采用方差分析t檢驗,P＜0.05為有顯著性統計學意義。

2 結 果

結腸癌組織TLR-4m RNA表達量明顯高于癌旁組織(P＜0.01)。低分化型結腸癌高于高、中分化結腸癌(P＜0.01)。有淋巴結轉移者與無淋巴結轉移者 TLR-4mRNA表達量差異無顯著性(P＞0.05)。Dukes'A期 TLR-4mRNA表達量低于B、C、D期(P＜0.01),B、C、D期之間差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

表1 結腸癌患者TLR-4mRNA表達結果比較(±s)

表1 結腸癌患者TLR-4mRNA表達結果比較(±s)

注:與癌旁組織比較,1)P＜0.01;與高、中分化結腸癌比較,2)P＜0.01;與Dukes'A期結腸癌比較,3)P＜0.01

n TLR4 mRNA拷貝數結腸癌 63 86.42±15.161)癌旁組織 63 32.74±9.44高分化結腸癌 23 69.58±11.27中分化結腸癌 17 64.57±13.91低分化結腸癌 20 97.12±15.442)結腸癌伴淋巴結轉移 27 89.91±13.22結腸癌不伴淋巴結轉移 36 81.16±13.59 Dukes'A期結腸癌 18 59.05±11.66 Dukes'B期結腸癌 14 92.32±17.513)Dukes'C期結腸癌 22 91.41±15.213)Dukes'D期結腸癌 9 101.46±17.343)

3 討 論

研究證實,腫瘤細胞尤其是上皮源性腫瘤細胞表面存在TLR,其在腫瘤的發病機制和生物免疫治療中可能起到一定的作用。TLR可被存在于局部的相應配體激活,啟動上皮細胞的惡性表型轉化,同時分泌細胞因子,刺激腫瘤細胞生長。TLR-4信號途徑的持續激活被認為是慢性炎癥持續存在進而發展為惡性腫瘤的重要原因[1,2]。

本文結果表明63例結腸癌組織中TLR-4 mRNA的表達比鄰近正常結腸組織明顯升高,提示TLR-4基因高表達可能參與了結腸癌的發生發展,其機制與TLR-4介導腫瘤細胞的免疫逃逸和浸潤功能有關,結腸癌細胞本身或者其釋放的細胞因子作為TLR-4配體發揮作用,激活 TLR-4,上調TLR-4 m RNA水平,通過一系列信號途徑,誘發結腸癌。近來在肺癌、喉癌的研究中也發現,TLR-4在癌細胞或浸潤炎癥細胞上的高表達與腫瘤的免疫逃逸密切相關[3,4]。

本文結果顯示低分化型(包括Dukes'B、C、D期)結腸癌TLR-4m RNA明顯高于高、中分化(Dukes'A期)結腸癌,且從高分化到低分化表現為漸進性上升,提示TLR-4參與了結腸癌的分化進程。但結腸癌淋巴轉移與否的TLR-4mRNA表達沒有明顯差異,提示TLR-4基因表達水平高低不能區分結腸癌是否經淋巴轉移。

1 Bauera K,Dixon D,Degraff L M,et al.Toll-lik e receptor 4 in buty latod hydroxytoluene-induced mouse pulmonary inflammation and tumorigenesis.J Nail Cancer Inst,2005,97(23):1 778～1 781.

2 Ishida I,Kubo H,Suzuki S,et al.Hypoxia diminishes Toll-like receptor 4 expression through reactive oxygen species generated by mitochondfia in endothelial ceils.J Immunol,2002,169(4);2 069～2 075.

3 He W,Liu Q,Wang L,et al.TLR4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.Mol Immunol,2007,44(11):2 850～2 859.

4 Szczepański M,Stelmachowska M,Stryczyński L,et al.Assessment of expression of toll-like receptors 2,3 and 4 in laryngeal carcinoma.EurArch Otorhinolaryngol,2007,264(5):525～530.