雌激素與人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子(hUAT)基因表達(dá)的相關(guān)性研究

盧彥敏,王 霞,付正菊,宋 娓,李長貴,付愛榮

(1.青島經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)第一人民醫(yī)院保健科,山東266555;2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,山東266003)

近年來隨著人們生活水平的提高,原發(fā)性高尿酸血癥的患病率明顯上升,人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子(human urate transporter,hUAT)是調(diào)節(jié)腎尿酸分泌的關(guān)鍵物質(zhì),進(jìn)入腎近端小管上皮細(xì)胞內(nèi)的尿酸鹽50%由其介導(dǎo)分泌到管腔,經(jīng)腎臟排出體外[1]。推測(cè)hUAT基因低表達(dá)或功能降低可能是原發(fā)性高尿酸血癥的重要發(fā)病原因。目前,對(duì)雌激素在尿酸排泄中的作用研究發(fā)現(xiàn),絕經(jīng)后合并高尿酸血癥的女性應(yīng)用雌激素替代療法可使血尿酸水平明顯下降[2-3]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)雌激素通過何種機(jī)制降低血尿酸水平進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料 腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞,購自中國典型培養(yǎng)物收藏中心CCTCC細(xì)胞庫),雌激素(Merck公司),T rizol RNA抽提試劑(Takara公司),DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen GIBCO公司),hUAT、甘油醛 3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和 Taqman熒光探針、引物(寶生物工程大連有限公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 細(xì)胞培養(yǎng)于DM EM培養(yǎng)基中,外加10%胎牛血清,每3～4天換液1次,至細(xì)胞生長達(dá)90%匯合后進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞為第3～5代細(xì)胞(將從液氮中復(fù)蘇的未知代細(xì)胞定為第1代)。取匯合達(dá)90%的細(xì)胞經(jīng)胰酶/EDTA消化制成細(xì)胞懸液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞生長達(dá)匯合,棄去含血清的培養(yǎng)液,用PBS清洗3遍后換無血清培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞同步處于G0期。以后所有實(shí)驗(yàn)均在無血清條件下進(jìn)行。

取培養(yǎng)后同步處于G0期的HK-2細(xì)胞,按繼續(xù)培養(yǎng)條件的不同分為5組:B0組(DMEM+乙醇對(duì)照組)、B1組(DMEM+10-12mol/L雌激素+0.5%乙醇)、B2(DMEM+10-10mol/L雌激素+0.5%乙醇)、B3組(DMEM+10-8mol/L雌激素+0.5%乙醇)、B4組(DM EM+10-6mol/L雌激素+0.5%乙醇),每組均培養(yǎng)6瓶細(xì)胞。上述細(xì)胞在不同培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)48 h,用胰酶消化,離心后抽提總RNA及總蛋白。

1.2.2 HK-2細(xì)胞總RNA抽提及cDNA制備 應(yīng)用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,制備cDNA。反應(yīng)體系如下:2 μ L的 5×primer buffer、0.5 μ L prime enzyme mixI、0.5 μ L oligo dT primer和 0.5μ L random 6 mers,終體積為 20 μ L。 向反應(yīng)體系中加入 0.5 μ g/μL 的 RNA 1 μ L,37 ℃水浴 15 min,85 ℃加熱5 s。逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA用作PCR反應(yīng)的模板,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同濃度雌激素對(duì)hUAT基因表達(dá)的影響(x ±s)

1.2.3 hUAT mRNA表達(dá)的檢測(cè) hUAT、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因引物與探針均由寶生物工程(大連)有限公司設(shè)計(jì)合成,采用看家基因GAPDH進(jìn)行標(biāo)化。hUAT上游引物:5′-ATG GTC AGC ACC TGT T TG AAT AC-3′,下游引物 :5′-CAG GAA GCC GCC TA T GTC TG-3′;TAQMAN探針 5′-ACC ATC GCC TGA GGA ACC TGC CCA-3′,擴(kuò)增片段長度為115 bp。內(nèi)參GAPDH 上游引物:5′-GGA CCT GAC CTG CCG TCT AG-3′,下游引物:5′-TAG CCC AGG ATG CCC TTG AG-3′;TAQMAN 探針 5′-CCT CCG ACG CCT GCT TCA CCA CCT-3′,擴(kuò)增片段長度 99 bp。取同一個(gè)cDNA為模板進(jìn)行hUAT、GAPDH的 PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下:2 μ L cDNA 、1.6 μL 探針 引物 、10 μ L Premix ExTaq、0.4 μ L ROXⅡ和6 μ L 超純水,終體積為 20 μ L。 按如下程序擴(kuò)增:96孔反應(yīng)板置于熒光定量PCR擴(kuò)增儀,反應(yīng)參數(shù)如下:95℃、10 s,95℃、5 s,60℃、45 s,40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用 SDS軟件自動(dòng)分析,給出各反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和Ct值。依照文獻(xiàn)[4-8]的方法進(jìn)行定量PCR的檢測(cè)與分析。熒光定量PCR的結(jié)果以Ct值顯示。Ct值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定區(qū)域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次,取平均值為Ct值,用SPSS11.5軟件計(jì)算出各段各基因表達(dá)的平均Ct值,采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較各基因的表達(dá)差異[4-6]。以 B0組表達(dá)量為1,2-△△Ct值,即為目的段較正常段基因表達(dá)的倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示,兩組間比較采用非配對(duì) t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

不同濃度雌激素對(duì)hUAT基因表達(dá)的影響見表1、彩插Ⅰ圖1。加入不同濃度激素培養(yǎng)48 h的各組 HK-2均上調(diào)hUAT基因的表達(dá)。隨雌激濃度增加,hUA T mRNA水平明顯升高。與B0組比較,B3、B4組hUAT mRNA水平明顯升高(P＜0.05),B1、B2組hUAT mRNA水平變化不明顯(P＞0.05)。與B1、B2組比較,B3和B4組hUAT mRNA水平明顯升高(P＜0.05)。B3組與B4組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。B1組與B2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。B4組hUAT mRNA水平最高,是 B0組的1.87倍。

3 討 論

高尿酸血癥目前已成為嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病,對(duì)高尿酸血癥防治的研究已成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

hUAT是近年來發(fā)現(xiàn)的與尿酸排泄有關(guān)的管道蛋白,是尿酸由細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞外的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)子,hUAT廣泛分布于各種組織細(xì)胞中。乳糖和葡萄糖可調(diào)節(jié)其活性,尿酸酶特異阻斷劑——OxOnate、抗結(jié)核藥物——吡嗪酰胺(PZA)、腺苷在胞漿外側(cè)均可阻斷重組hUAT的通道活性,影響hUA T對(duì)尿酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。進(jìn)入腎近端小管的尿酸鹽50%由其介導(dǎo)分泌到細(xì)胞外,排出體外。因此,推測(cè)其功能降低將導(dǎo)致腎臟對(duì)尿酸的排泄減少[9-10],導(dǎo)致高尿酸血癥。Hong等[11]研究發(fā)現(xiàn),高尿酸環(huán)境中,人腎小管上皮細(xì)胞hUA T mRNA水平明顯上調(diào)。提示hUAT在尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用。hUAT與高尿酸血癥的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示女性在絕經(jīng)前血尿酸水平明顯低于男性,絕經(jīng)后血尿酸水平與男性相似,因此,世界衛(wèi)生組織對(duì)女性高尿酸血癥的定義為:絕經(jīng)前血尿酸水平大于357 μ mmol/L即可診斷為高尿酸血癥,絕經(jīng)后與男性相同,即大于416μ mmol/L才可診斷為高尿酸血癥。此外,大量臨床資料及近期對(duì)山東沿海地區(qū)高尿酸血癥和痛風(fēng)的流行病學(xué)調(diào)查資料也顯示女性痛風(fēng)和高尿酸血癥患病率明顯低于男性。提示性激素在維持機(jī)體尿酸的平衡中發(fā)揮重要作用。但性激素通過何種機(jī)制降低血尿酸水平,目前仍不清楚。

本研究結(jié)果顯示,雌激素可直接調(diào)節(jié)hUAT基因的表達(dá),雌激素水平越高,hUAT mRNA水平越高。該結(jié)果說明雌激素通過上調(diào)hUAT基因的表達(dá),促進(jìn)腎臟尿酸排泄,是女性維持機(jī)體尿酸水平穩(wěn)定的保護(hù)因素,可能是絕經(jīng)前、后女性高尿酸和痛風(fēng)發(fā)病率明顯不同的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)雌激素達(dá)到一定濃度后對(duì)hUAT基因的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此,作者認(rèn)為在尿酸代謝的過程中存在雌激素的作用“閾值”,正常生理狀態(tài)下,體內(nèi)雌激素濃度高于該閾值時(shí),雌激素發(fā)揮正相調(diào)節(jié)功能,體內(nèi)尿酸水平得以維持正常;而在女性絕經(jīng)后或是某些病理狀態(tài)下,體內(nèi)雌激素水平降低,達(dá)不到其作用閾值,雌激素對(duì)相關(guān)尿酸基因的正向調(diào)節(jié)功能減弱,尿酸排泄減少,血尿酸水平升高。同時(shí),參與腎臟尿酸排泄的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還包括陰離子交換器1(URAT1)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子1(OAT1)和OA T3等,因此,可對(duì)上述基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),以提供更全面的資料,從而進(jìn)一步研究雌激素對(duì)尿酸排泄的影響。

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