TSA對食管癌細(xì)胞系EC9706細(xì)胞周期作用及分子機(jī)制的探討

劉 霞,馮 婷,馬俊芬,趙繼敏,楊洪艷,黃幼田,董子明

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室 450052)

組蛋白乙?；?histoneacetylase,HAT)和組蛋白去乙?；?histonedeacetylase,HDAC)是調(diào)節(jié)組蛋白乙?；癄顟B(tài)的一對功能相互拮抗的蛋白酶,它們相互的動態(tài)平衡控制著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)。曲古菌素A(trichostatin A,TSA)是一種組蛋白去乙?；?histonedeacetylase,HDACs)抑制劑,能夠抑制HDACs的活性。由于它能夠改變組蛋白的乙?；癄顟B(tài),從而可以選擇性地調(diào)控腫瘤相關(guān)基因。近年來,研究提示去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑可明顯抑制腫瘤的生長,雖然目前對其作用機(jī)制仍不十分清楚,但其中一個重要機(jī)制是通過阻滯細(xì)胞周期來實現(xiàn)其細(xì)胞抑制作用的[1]。具體的機(jī)制因去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑藥物和腫瘤的各異而不同。調(diào)控的相關(guān)基因也不相同。TSA對食管癌細(xì)胞周期影響的尚未見報道,因此,本研究主要觀察TSA對食管癌EC9706細(xì)胞周期的影響,探討TSA對EC9706細(xì)胞周期發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 TSA購自Sigma(USA)公司,由DMSO溶解至1 mol/L,使用前按照相應(yīng)濃度稀釋加入培養(yǎng)基中。RPMI-1640購自Gibco BRL公司,胎牛血清購自天津TBD生物有限公司,P21、P27、CyclinD1鼠抗人單抗和抗CDK4多抗購自美國Santa Cruz;ECL顯色試劑盒購自北京中杉生物工程公司,蛋白垂直電泳儀和印跡轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司,流式細(xì)胞儀購自FACSsort,BD公司,食管癌細(xì)胞株 EC9706由鄭州大學(xué)病理生理學(xué)教研室提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將EC9706細(xì)胞放在含10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 mg/mL青霉素的RPM I-1640培養(yǎng)液里,放在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞處理后分組,實驗組分為 0.5、1.0、1.5 μ mol/L TSA。對照組換為等濃度的DMSO同時培養(yǎng)24 h后收集。

1.3 TSA細(xì)胞生長抑制試驗(MT T法) 實驗分組:實驗組,細(xì)胞分別給予 0.5、1.0、1.5 μ mol/L TSA 處理,使用不含胎牛血清的培養(yǎng)基;空白對照組M TT法檢測不同濃度 TSA對細(xì)胞生長的抑制作用,細(xì)胞經(jīng)0.05%胰酶消化處理制成3×104個/mL細(xì)胞懸液,接種在96孔板中,每孔加入100 μ L,每個濃度設(shè)6個復(fù)孔,以未加藥細(xì)胞作為對照,待細(xì)胞貼壁后,分別加入 0.5、1.0、1.5 μ mol/L TSA 作用 24 h 后,加入 20 μL M TT(5 mg/mL)在5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h后棄上清液,每孔再加入150 μ L DMSO,待充分溶解后輕微搖床振蕩10 min,上酶標(biāo)儀檢測,用波長570 nm比色測定OD值,計算抑制率。抑制率(%)=(空白對照組OD570-實驗組OD570)/對照組OD570。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期的EC9706細(xì)胞,以無血清的RPMI-1640培養(yǎng)24 h同步后,按照上述分組作用24 h后,以PBS洗滌,用 70%的冷乙醇在4℃以下固定24 h以上,然后離心棄乙醇(3 000 r/min離心10 min),再加入1 mL PBS制成細(xì)胞懸液后加入 RnaseA酶(終濃度為 10 μ g/mL),室溫放置30 min,再用 50 μ g/mL的碘化丙啶(PI)染色后,用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.5 Western Blot檢測 p21、p27、CCND1、CDK4D 蛋白的表達(dá) 參照《分子克隆實驗指南》提取腫瘤細(xì)胞總蛋白,測定濃度后,在標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線下算出50 μ g蛋白上樣量,以 B-actin為內(nèi)參照,Western Blot檢測腫瘤細(xì)胞表面各基因的表達(dá)。將蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%BSA搖床封閉3 h后加入相應(yīng)的一抗,4℃冰箱孵育過夜,TBST洗滌3次,二抗孵育1 h后用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行X線膠片曝光顯影。用凝膠成像儀進(jìn)行圖像定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理,多樣本均數(shù)采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TSA對EC9706細(xì)胞增殖影響 見表1,不同濃度TSA處理 EC9706細(xì)胞 24 h后,與空白對照組比較,0.5 μ mol/L TSA處理組細(xì)胞的抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而1.0 μ mol/L TSA處理的細(xì)胞抑制率顯著增加,并隨著TSA作用濃度的升高而升高(P＜0.05)。

表1 不同濃度的TSA對EC9706細(xì)胞增殖的影響(±s,n=6)

表1 不同濃度的TSA對EC9706細(xì)胞增殖的影響(±s,n=6)

與空白對照組比較,*:P＜0.05;不同濃度TSA處理組間兩兩比較,#:P＜0.05。

組別 抑制率(%)空白對照組 7.8±3.74 0.5 μ mol/L TSA 處理組 7.96±0.12#1.0 μ mol/L TSA 處理組 20.03±0.21*#1.5 μ mol/L TSA 處理組 26.40±0.58*#

圖1 不同濃度TSA對EC9706細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

2.2 TSA對EC9706細(xì)胞細(xì)胞周期的作用 見圖 1,0.5、1.0、1.5 μ mol/L TSA 作用 EC9706細(xì)胞24 h 后,與空白對照組比較,0.5 μ mol/L TSA處理組細(xì)胞的周期無明顯差異,而1.0 μ mol/L TSA處理后滯留在G1期的細(xì)胞顯著增加,S期細(xì)胞明顯減少,并隨著TSA作用濃度的升高阻滯在G1期的細(xì)胞顯著增高(P＜0.05)。

2.3 EC9706 細(xì)胞 p21、p27、CCND1、CDK4D 的表達(dá)變化 見圖 2,0.5、1.0、1.5 μ mol/L TSA 作用 EC9706 細(xì)胞 24 h 后,與空白對照組比較,0.5 μ mol/L TSA 處理組細(xì)胞 p21、p27、CCND1、CDK4D蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而 1.0 μ mol/L TSA處理的細(xì)胞p21、p27蛋白的表達(dá)顯著提高,并隨著TSA作用濃度的升高而增加(P＜0.05),CCND1、CDK4D蛋白的表達(dá)顯著下降,并隨著TSA作用濃度的升高而降低(P＜0.05)。

圖 2 EC9706 細(xì)胞 p21、p27、CCND1、CDK4D 的表達(dá)變化

3 討 論

組蛋白的乙酰化和去乙?；饕峭ㄟ^HAT和HDAC來實現(xiàn)的[2]。生理狀態(tài)下,它們相互的動態(tài)平衡控制著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)。一旦平衡在異常狀態(tài)下被破壞,HDAC活性增強(qiáng),原有的基因表達(dá)失衡,調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的分子表達(dá)紊亂,從而導(dǎo)致細(xì)胞惡變。組蛋白去乙?；种苿┛梢允鼓承┎课坏暮诵慕M蛋白高度乙?；?導(dǎo)致某些基因的啟動子激活,從而使與周期相關(guān)的蛋白得到表達(dá),進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)增生停止、分化、凋亡轉(zhuǎn)移抑制等變化。TSA是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HADCI),能特異地抑制組蛋白去乙?；?使高度酰基化的組蛋白積累,改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu),抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和(或)凋亡,是一類具有廣泛應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物之一[3]。有研究表明,TSA可以以時間和劑量依賴性方式顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖,本研究證實了TSA可以抑制腫瘤細(xì)胞生長,可使食管癌細(xì)胞EC9706細(xì)胞周期停滯于G0/G1期。并且發(fā)現(xiàn) 0.5 μ mol/L TSA作用 EC9706細(xì)胞對細(xì)胞生長無明顯影響,與空白對照組比較抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而 1.0 μ mol/L TSA作用EC9706細(xì)胞顯著抑制細(xì)胞生長,并且抑制率明顯增加,并且表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。進(jìn)一步研究表明TSA對食管癌細(xì)胞周期的阻滯作用是通過調(diào)控一些細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來起作用的,TSA可以明顯增加p21、p27等許多細(xì)胞周期抑制基因的表達(dá),同時降低了CCND1、CDK4D等細(xì)胞周期促進(jìn)基因的表達(dá),并且隨著TSA作用濃度的增加而增強(qiáng)。p21、p27是細(xì)胞周期調(diào)控中非常重要的基因,能夠與CCND1形成復(fù)合物使細(xì)胞周期停滯在G1期;它還可以通過C端與PCNA相互作用,阻斷PCNA活化DNA聚合酶的活性從而抑制DNA的合成,使細(xì)胞周期停滯[4-6]。其主要是抑制細(xì)胞周期,參與細(xì)胞的生長、分化、衰老及死亡過程,同時又與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),在細(xì)胞的生理、病理過程中發(fā)揮重要的作用。而CCND1過表達(dá)與某些腫瘤的組織類型相關(guān),其功能主要是促進(jìn)細(xì)胞增殖,是G1期細(xì)胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白質(zhì),被視為癌基因,其過度表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控而惡性化,但是它在不同腫瘤中陽性檢出率不同,與組織分化程度相關(guān),在分化差的腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)。CDK則是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,包括CDK1～7種,主要生物學(xué)作用是啟動DNA的復(fù)制和誘發(fā)細(xì)胞的有絲分裂[7-8],以復(fù)合物形式出現(xiàn),在G1早期,CCND表達(dá)并與CDK2或CDK4結(jié)合,成為始動細(xì)胞周期的啟動子[9-12],1.0 μ mol/L濃度的TSA對EC9706細(xì)胞有明顯的生長抑制作用,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)TSA在1.0 μ mol/L濃度之上可明顯誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞EC9706細(xì)胞周期阻滯,可明顯增強(qiáng)EC9706細(xì)胞中p21、p27等基因的表達(dá),明顯降低 CCND1、CDK4D等基因的表達(dá),但是否TSA抑制EC9706細(xì)胞的生長還與其它基因表達(dá)的改變相關(guān),具體的機(jī)制有待繼續(xù)研究探討。

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