高碳酸酸化預處理對臍靜脈血管內皮細胞凋亡的影響*

羅和國,常業恬,鄒望遠,鄒定全,王德明

(1.江西省人民醫院麻醉科,南昌330006;2.中南大學湘雅二醫院麻醉科,長沙410011)

研究表明缺血缺氧預處理對血管內皮細胞(endothelial cells,EC)具有保護作用,減少血管內皮細胞的凋亡,促進慢性缺血心肌內的血管生成。缺血或是缺氧預處理的臨床應用受到限制。高碳酸酸化可激活EC的KATP通道,保護EC[1]。其對EC凋亡的影響尚未可知,本研究擬通過觀測高碳酸酸化預處理后缺氧復氧EC凋亡的變化,來進一步證實高碳酸酸化預處理的血管保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DM EM培養基購自美國Gibco公司,RNase購自美國Genview公司,人臍靜脈EC來源于人臍靜脈內皮細胞系:ECV-304,30～50代,購自中南大學湘雅醫學院細胞中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養 細胞復蘇:將EC凍存管從液氮罐中取出,快速于37℃水浴中使其完全融解后,1 000 r/min離心5 min,將凍存液于超凈臺中棄去,將DMEM完全培養基逐滴加入凍存管,將細胞重懸,再將細胞懸液緩慢加入已加好培養基的培養瓶中,放入 5%CO2、37℃培養箱中培養,24 h后換液。細胞傳代:當EC對數生長至細胞密度達80%左右傳代。棄去培養瓶內舊培養基,用D-Hank′s液漂洗 3次,加0.25%胰蛋白酶1 mL于瓶中,使細胞充分接觸消化液,鏡下見EC變圓、分散、部分脫離瓶底后,加5 mL完全培養基終止消化,用吸管吹打細胞懸液,將此瓶細胞懸液分成2份加入新瓶中,各瓶再加4 mL完全培養基,放入培養箱中繼續培養。

1.2.2 實驗分組 臍靜脈EC培養傳代后按處理方式不同分為6組(n=12):正常對照組(C組),缺氧復氧組(H/R組),缺氧預處理組(HPC組),30%CO2預處理 EC 10、30、60 min組(10、30、60 min HCA 組)。H/R 組將細胞置于 95%N2、5%CO2的缺氧培養箱中缺氧培養 4 h,再在 21%O2、5%CO2、74%N2的正常培養箱中復氧孵育24 h。HPC組將細胞置于缺氧培養箱中先行2個循環的缺氧10 h及正常培養箱中復氧10 h,其余處理方法同H/R組。10、30、60 min HCA組將細胞置于21%O2、30%CO2、49%N2培養箱中先行高碳酸酸化預處理10、30、60 min,其余處理方法同 H/R組。C組將細胞置于正常培養箱至實驗結束。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 細胞形態學觀察 光學檢查:用倒置顯微鏡觀察細胞,并照相。

1.2.3.2 Hoechst 33342染色 倒去EC細胞培養瓶中的液體,PBS洗2次;用 10%甲醛浸泡 5 min,吸去甲醛,加入 PBS浸泡 5 min,吸去甲醛,重復 3次;加入4 mL PBS,加入 4 μ L Hoechest工作液;避光染色25 min,吸去染液,用PBS浸泡 1～2 min,吸去 PBS,重復3次;加入適量PBS蓋住細胞,于熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.2.3.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將EC以3×104個/mL密度接種于25 mL培養瓶中,10%血清培養過夜,細胞貼壁后換2%血清進行不同培養環境的干預,干預結束后繼續在正常培養箱中培養24 h,用胰蛋白酶消化細胞,制成單細胞懸液,然后1 000 r/min離心5 min,棄上清液,將收集的細胞用 4℃預冷的70%冷乙醇固定,4℃保存,至少固定18 h,調整細胞濃度為106個/mL,取 1 mL細胞懸液,用PBS洗 3次,細胞重懸于1 mL PI染液中,37℃孵育30 min即可進行流式分析。用流式細胞儀檢測凋亡細胞占所測細胞總數的百分比,即凋亡指數(AI)。PI染液終濃度為 50 μ g/mL,RNase A終濃度為 20 μ g/mL。每組樣本數量為 12。

2 結 果

2.1 培養EC的一般特征 正常EC在倒置生物顯微鏡下為多角形或短梭形,接種培養6 h后EC開始貼壁生長,胞漿致密,呈網狀,8 h活細胞已全部貼壁,貼壁后的細胞開始分裂成簇,細胞生長旺盛,細胞簇面積增大,并向周圍伸出放射狀突起,相互連接成網(彩插Ⅰ圖1、2)。

2.2 凋亡細胞的形態學改變 經Hoechest染色后可見凋亡細胞的核濃縮、皺裂(彩插Ⅰ圖3、4)。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 HPC組,10、30、60 min HCA組凋亡指數小于H/R組,P＜0.01。30 min HCA組的凋亡指數小于10 min HCA組,P＜0.01。30 min HCA組的凋亡指數小于60 min HCA組,P＜0.05(表1)。

表1 各組細胞凋亡指數

3 討 論

細胞凋亡是生物界重要的生命現象之一,指的是細胞的程序性死亡,表現為細胞核的皺裂、濃縮和水解[2-4]。在本研究中觀察到,臍靜脈EC在缺氧復氧的環境下培養后可導致細胞的凋亡,臍靜脈EC經Hochest染色后表現出細胞凋亡的典型特征:細胞核出現皺裂、濃縮和水解,從而引起血管內皮結構或功能受損。血管內皮結構或功能受損可導致血管通透性增加,加重心肌水腫,同時也會引起血管舒縮異常,張力增加,使血小板黏附和聚集,形成血栓,進而導致心肌灌注不足,加重缺血再灌注損傷[5-8]。

本研究亦觀察到,經高碳酸酸化預處理的EC,其凋亡指數小于缺氧復氧組的EC,30 min HCA組抑制凋亡的效果最大,這表明高碳酸酸化預處理能夠通過抑制EC的凋亡來保護細胞。生物體內環境的穩定,不但依賴細胞增殖和分化,也依賴于細胞的凋亡[9-10],凋亡的發生是細胞受促進性和抑制性雙向基因共同調節的結果[11-13]。有研究表明KATP通道的抑制劑能夠促進EC的凋亡,KATP通道的開放則能夠抑制EC的凋亡[14]。KATP通道的開放劑的這一作用與其能夠消除缺氧所致的核c-Fos和 c-Jun的表達上調有關[15]。已知高碳酸酸化能夠激動KATP通道,因而高碳酸酸化預處理抑制凋亡的機制可能是通過激動KATP通道,上調凋亡促進基因的表達及下降凋亡抑制基因的表達來實現的。

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