siRNA對體外培養(yǎng)紅系細胞α-珠蛋白基因表達的影響*

羅 琳,賴永榕,劉容容

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,南寧530021)

對重型β-珠蛋白生成障礙性貧血,目前臨床上缺乏有效的治療手段。基因治療是珠蛋白生成障礙性貧血治療的希望。基因治療靶向首選的是調(diào)控β珠蛋白基因,其次是減少α/β珠蛋白鏈的不平衡。減少α珠蛋白鏈的合成,改善α與非α鏈珠蛋白的合成失衡,減少紅細胞內(nèi)包涵體的形成,減少溶血,改善β-珠蛋白生成障礙性貧血癥狀,這一新的治療方式引起了人們的興趣。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要的基因表達調(diào)控方式,自1998年發(fā)現(xiàn)RNAi以來[1],其機制研究和應用突飛猛進。本研究設計靶向α-珠蛋白基因的小分子干擾 RNA(siRNA),經(jīng)脂質(zhì)體(Oligofectamine,Invitrogen,Ca.t No.12252-011)轉染體外培養(yǎng)的紅系前體細胞,從分子水平部分抑制α-珠蛋白基因表達,減少α珠蛋白肽鏈合成,篩選獲得有效抑制α-珠蛋白基因的siRNA及最佳作用濃度,為后期選取適宜的siRNA作用于體外培養(yǎng)的重型β-珠蛋白生成障礙性貧血患者的紅系細胞提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 體外液體培養(yǎng)正常人外周血紅系細胞 用CS-3000 plus血細胞分離機采集rhG-CSF動員的正常移植供者外周血0.5～1 mL,制備單個核細胞(MNC)懸液。調(diào)整細胞濃度至5～6×106個/mL,參照 Wojda等[2]方法,加入 RPMI-1640培養(yǎng)基,內(nèi)含1%牛血清清蛋白、10-4mol/L 2-巰基乙醇、2 mmol/L L-谷氨酰胺、10-6mol/L地塞米松、30%胎牛血清和3 u/mL rhEpo、總體積為10 mL、混勻后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng),每4天更換全部舊培養(yǎng)基1次,加入等體積新鮮培養(yǎng)基(含相同濃度的上述成分)。換液同時取部分細胞,制片染色,觀察培養(yǎng)的紅系細胞形態(tài)學特征。

1.2 siRNA設計、合成 從基因庫獲得α-珠蛋白基因mRNA全序列(GenBank:NM000517),應用 Ambion公司的在線 siRNA序列設計工具,選擇3條siRNA,并用前期預實驗進行分析和篩選;獲得最佳 siRNA:Sense 5′-AGG UUA AGG GCC ACG GCA ATT-3′,Antisense 5′-UUG CCG UGG CCC UUA ACC UGG-3′。siRNA由上海 Genepharma公司合成、純化、分裝,并在5′端標記熒光(FAM),以檢查轉染效率。同時合成與目的基因序列無同源性的陰性對照組及GAPDH陽性對照組。

1.3 siRNA的脂質(zhì)體轉染 按照脂質(zhì)體說明書的步驟操作,在轉染前1 d將紅系細胞按5×105個/mL在無血清條件下接種于24孔培養(yǎng)板,脂質(zhì)體、siRNA均用Opti-MEM IMedium(Invitrogen,Ca.t No.31985-062)溶解,siRNA組設定5個終濃度:40、80、120、160、200 nmol/L。同時設陰性對照組、空白對照組。置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.4 流式細胞儀檢測脂質(zhì)體轉染效率 分別于siRNA作用24、48、72 h后,取部分細胞,經(jīng) PBS洗滌 2次,應用流式細胞儀(Beckman Coulter公司產(chǎn)品,Epics XL型)進行檢測,數(shù)據(jù)采用Cell Quest軟件分析。

1.5 RT-PCR法檢測紅系細胞中α-珠蛋白基因表達

1.5.1 RNA提取 參照TRIzoL試劑說明書分別提取上述各細胞中的總RNA。用紫外分光光度計測RNA濃度(RNA濃度=A260×40 μ g/mL×1/光徑 ×稀釋倍數(shù))及純度(A260/A280比值在1.8～2.0),再用2%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA質(zhì)量,而后將RNA儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 cDNA合成 根據(jù)TaqMan逆轉錄試劑盒[RNA PCRKit(AM V)Ver.3.0,CatNo.DRR019A]說明書,把 1μ g 總RNA反轉錄成為單鏈cDNA,反應獲得cDNA儲存于-20℃?zhèn)溆谩悠窚蕚?PCR加樣和PCR產(chǎn)物檢測分析均在相互獨立的環(huán)境中完成。

1.5.3 RT-PCR iCycler iQTM熒光實時PCR儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。SYBR GreenⅠ(for QPCR)購自捷瑞生物工程(上海)有限公司(Code:RS0976),PCR反應體系20 μ L含cDNA模板1 μ L,引物各5 pmol。PCR反應條件為:95℃預熱3 min,緊接著35個循環(huán)的 95℃變性30 s、60℃退火30 s和 72℃延伸30 s,熱循環(huán)完成后進行55～95℃的溶解曲線測定。PCR反應結束后由電腦自動分析出定量結果。所有樣品檢測實驗均包含1個無模板的陰性對照以排除假陽性結果,見表1。每個樣品中α-珠蛋白基因的相對mRNA表達水平可以用公式計算 :相對 mRNA 表達 =2-ΔΔCt[3]。

表1 引物序列及擴增片斷長度

1.6 臺盼蘭拒染率檢測細胞存活 分別于轉染24、48、72 h后取部分細胞,檢測臺盼蘭拒染率,了解細胞存活情況。

2 結 果

2.1 體外液體培養(yǎng)體系中紅系細胞形態(tài)學特征 培養(yǎng)4 d時,體系中部分細胞呈現(xiàn)出原始紅細胞特征,核為圓形或橢圓形,核染色質(zhì)為紫藍色,較細致,可見1～2個核仁,胞漿量少,無顆粒;培養(yǎng)第8天時(轉染siRNA當天),上述細胞進一步分化,核染色質(zhì)開始凝集,核仁消失,胞漿量增多,見圖1。

2.2 流式細胞儀檢測脂質(zhì)體轉染siRNA效率 紅系細胞用Oligofectamin轉染帶有FITC熒光素的 siRNA后24、48、72 h分別收集部分細胞,流式細胞儀檢測FITC細胞百分率分別為61.2%、44.3%、33.7%。檢測結果顯示,轉染效率隨作用時間的遞增而逐漸減低,見圖2。

2.3 脂質(zhì)體轉染siRNA作用后α-珠蛋白基因的表達 結果表明,siRNA對α-珠蛋白基因表達的抑制效應在一定范圍內(nèi)具有濃度及時間依賴特性。濃度越高,抑制效應越高。不同濃度siRNA的α-珠蛋白基因相對表達量之間相互比較:120、160、200 nmol/L組相對表達量低于 40、80 nmol/L組(P＜0.05),80、40 nmol/L 組之間,200、160、120 nmol/L 組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。各時間點的α-珠蛋白基因相對表達量之間比較:200、160、120 nmol/L 3組的相對表達量在48、72 h低于24 h(P＜0.05),但48、72 h之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表 2、圖3。

圖1 培養(yǎng)的紅系細胞形態(tài)學特征

圖2 流式細胞儀檢測脂質(zhì)體轉染siRNA效率

表 2 不同濃度siRNA作用后α-珠蛋白基因相對表達量(±s)

表 2 不同濃度siRNA作用后α-珠蛋白基因相對表達量(±s)

時間(h)siRNA濃度(nmol/L)40 80 120 160 200 24 0.67±0.01 0.61±0.02 0.55±0.02 0.52±0.01 0.51±0.01 48 0.60±0.02 0.54±0.01 0.42±0.02 0.39±0.02 0.38±0.01 72 0.57±0.01 0.52±0.02 0.39±0.01 0.36±0.02 0.34±0.02

2.4 臺盼蘭拒染率檢測細胞存活 不同濃度siRNA作用后,紅系細胞臺盼蘭拒染率的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),濃度越高,臺盼蘭拒染率越低;且作用時間越長,臺盼蘭拒染率也越低,見表3。

圖3 不同濃度siRNA作用后α-珠蛋白基因相對表達量

表3 不同濃度siRNA作用后細胞臺盼蘭拒染率

3 討 論

部分血液系統(tǒng)疾病是由于基因缺陷或變異造成的,而RNAi技術可以高效特異地抑制異常基因的表達,故RNAi技術在研究血液疾病在基因分子水平上的發(fā)病、致病機制、探討血液疾病的基因治療方法等領域有廣闊的應用前景。目前在血液系統(tǒng)腫瘤、腫瘤多藥耐藥、血紅蛋白病等方面都有較深入的研究[4-8]。在RNAi過程中起關鍵作用的物質(zhì)就是siRNA,為了保證實驗的順利進行,作者選擇了質(zhì)量可靠、純度高并且可以修飾的化學合成法制備siRNA。在前期的預實驗中,作者已篩選出最佳的siRNA序列。

相比其他的轉染試劑,脂質(zhì)體Oligofectamine對懸浮細胞有較高的轉染效率[9]。本研究采用脂質(zhì)體Oligofectamine作為轉染試劑,流式細胞術檢測轉染細胞后 24、48、72 h的熒光表達,分別為 61.2%、44.3%、33.7%,轉染效果較為滿意,能滿足實驗的進行。

本研究選用了 40、80、120、160、200 nmol/L作為測試濃度,結果顯示不同濃度siRNA作用于紅系細胞后其α-珠蛋白基因相對表達量的差異有統(tǒng)計學意義,濃度越高,抑制效應越大,但不同濃度siRNA之間比較提示在一定范圍內(nèi),siRNA的作用存在濃度依賴,但達到一定濃度后,即使增大濃度也不再提高抑制效應。各時間點的α-珠蛋白基因相對表達量之間比較提示siRNA作用后可在48 h或72 h觀察干擾效果。

王海燕等[10]應用不同濃度的dsRNA轉染大鼠的神經(jīng)干細胞,發(fā)現(xiàn)50～200 nmol/L濃度轉染組細胞均能正常生長,但形態(tài)存在明顯差異。0.5%錐蟲藍法檢測培養(yǎng)細胞活力及統(tǒng)計結果表明,各濃度組之間差異有統(tǒng)計學意義,濃度與細胞活力呈負相關,相關系數(shù)為-0.9。作者在研究中也觀察了siRNA不同濃度、不同時間對培養(yǎng)細胞存活情況的影響。發(fā)現(xiàn)不同濃度siRNA作用后,隨著作用濃度增加,培養(yǎng)的紅系細胞臺盼蘭拒染率越低,細胞死亡越多。而且作用時間越長,臺盼蘭拒染率也越低,細胞死亡越多。提示雖然高濃度siRNA能更有效地抑制靶基因的表達,但是高濃度對細胞的毒性也不可低估,低濃度的siRNA則更有利于細胞存活。

對于β-珠蛋白生成障礙性貧血,目前國內(nèi)外學者主要側重于對β珠蛋白鏈的研究,而甚少關注α珠蛋白鏈。不同于以往國內(nèi)外的研究,本研究設計針對α-珠蛋白基因的 siRNA,通過封閉部分α-珠蛋白基因,抑制相應的α珠蛋白鏈合成,改善α與非α珠蛋白鏈的比例失衡狀況,減少紅細胞內(nèi)包涵體的形成,減輕或緩解紅細胞溶血,達到治療β-珠蛋白生成障礙性貧血的目的,為探討基因調(diào)控治療β-珠蛋白生成障礙性貧血尋找新的靶點。

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