FasL和Der p2雙基因共表達真核表達載體的構建及其在樹突狀細胞中的表達*

王 彥,吳 奎,畢玉田,王長征

(第三軍醫大學新橋醫院全軍呼吸疾病研究所,重慶400037)

支氣管哮喘是由多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥性疾病。過去認為,Th1/Th2比例失衡導致Th2細胞過度活化是哮喘的主要發病機制。但是,目前研究認為,單純的Th1/Th2比例失衡并不能完全解釋哮喘的發病,免疫耐受缺陷和(或)異常可能是哮喘發病的重要機制[1-2]。Fas/FasL系統在誘導外周免疫耐受、保護免疫豁免組織逃避機體免疫系統的攻擊和維持免疫系統平衡,甚至腫瘤免疫逃逸中均起重要作用[3]。近年來,將FasL基因轉染樹突狀細胞(dendritic cell,DC)獲得可以誘導T細胞凋亡的“殺手DC”(FasL-DC),在誘導免疫耐受的研究中已越來越受到重視[4-5]。屋塵螨是哮喘患者的常見過敏原。因此,如果構建屋塵螨主要抗原Der p2和FasL基因共表達載體并轉染DC,有望誘導機體對屋塵螨過敏原產生特異性免疫耐受,從而達到防治哮喘的目的。在本實驗中,作者構建FasL和屋塵螨變應原Der p2雙基因共表達載體,并檢測了它們在小鼠骨髓來源的DC中的表達情況,為下一步研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 C57BL/6小鼠15只,雌雄不拘,體質量20～30 g,6～8周齡,購自重慶醫科大學實驗動物中心;pIRES2EGFP質粒購自Clontech公司;plambd-Der p2質粒購自美國HESKA公司;PCR引物用DNAstar軟件設計并訂購于賽百盛公司;重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)購自Peprotech公司;高保真RT-PCR試劑盒購自Toyobo公司;限制性內切酶購自Takara公司;脂質體轉染劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;質粒提取試劑盒購自Omega公司;TRI reagent購自M RC公司;RPMI-1640培養基和胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司;小鼠抗Der p2單抗購自英國 IB公司;兔抗小鼠FasL一抗、HRP標記或 cy3標記的羊抗兔IgG二抗分別購自Santa Cruz和中山公司。

1.2 PCR擴增Der p2基因 以plambd-Der p2為模板擴增Der p2質粒,引物如下,Der p2引物:擴增片段為426 bp(Der p2全長基因 396 bp+酶切位點+保護堿基),上游:5′-CTG CAG AAC CAC AAC CAT GGA TCA AGT CGA TGT CAA AGA-3′(BstXⅠ);下游:5′-ATA AGA A TG CGG CCG CT T TAA TCG CGG AT T TTA GCA TGA G-3′(NotⅠ)。反應條件:95 ℃、4 min→95 ℃、0.5 min→66 ℃、1 min→68 ℃、1 min。后3步進行35個循環,循環完成后68℃、5 min終止。經1%瓊脂糖凝膠電泳后,膠回收Der p2產物。

1.3 pIRES2EGFP-Der p2重組載體的構建及鑒定 BstXⅠ和NotⅠ雙酶切 pIRES2EGFP和 Der p2,切除 pIRES2EGFP中位于 IRES序列下游的 EGFP片段,切膠回收線性pIRES2EGFP載體片段和Der p2基因,在T4DNA連接酶作用下進行連接反應(16℃、16 h),將 Der p2基因片段克隆入pIRES2EGFP原 EGFP片段位置得 pIRES2EGFP-Der p2。將pIRES2EGFP-Der p2轉化 E.coli DH5α感受態細菌,氨芐青霉素(Kan)抗性篩選,陽性菌落擴增后抽提重組質粒,采用 NotⅠ和BstXⅠ雙酶切和PCR鑒定。

1.4 pIRES2EGFP-FasL-Der p2重組載體的構建及鑒定BamHⅠ和SalⅠ雙酶切 pMD18T-FasL和 pIRES2EGFP-Der p2,從pMD18T-FasL質粒雙酶切獲得FasL片段,切膠回收876 bp FasL條帶和線性pIRES2EGFP-Der p2載體片段,在T4DNA連接酶作用下進行連接反應(16℃、16 h),將FasL基因克隆入pIRES2EGFP-Der p2的IRES序列上游多克隆位點區獲得FasL和Der p2雙基因共表達重組載體pIRES2EGFPFasL-Der p2。將 pIRES2EGFP-FasL-Der p2轉化 E.coliα DH5感受態細菌,氨芐青霉素(Kan)抗性篩選,陽性菌落擴增后抽提重組質粒,用NotⅠ和BstXⅠ雙酶切,BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切分別鑒定Der p2和FasL,并將鑒定正確的重組質粒測序。

1.5 pIRES2EGFP-FasL-Der p2轉染樹突狀細胞 無菌條件下取C57BL/6小鼠完整的股骨、脛骨,離斷干骺端,以RPM I-1640培養液1 mL沖洗髓腔,獲得單細胞懸液,2 000 r/min離心 10 min,棄上清液,重懸于 RPMI-1640培養基,加入重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)至終濃度為20 ng/mL,繼續培養10 d后收獲細胞,用流式細胞儀(FACS)鑒定DC相對特異性表面分子CD11c表達后,進行下一步實驗。pIRES2EGFP-FasL-Der p2重組質粒與 LipofectamineTM2000按1 μ g∶3 L混合于50 μ L培養基,室溫下放置 30 min,形成轉染液復合物,加入培養在6孔板的DC中,常規培養24 h后,細胞換液并加入G418至200 μ g/mL,48 h后進行下一步實驗(FasL-Der p2-DC組)。以未轉染質粒和轉染空白質粒的DC為對照,每組5個樣本(n=5)。

1.6 RT-PCR檢測基因表達 合成FasL、Der p2和GAPDH共 3對 PCR引物:FasL引物(446 bp)上游:5′-GGG CTC CTC CAG GGT CAG TT T T-3′;下游:5′-TCC AGA GAT CAG AGC GGT TCC ATA-3′。Der p2 引物 2(234 bp)上游:5′-CGA AGC CAA CCA AAA CAC AA-3′;下游:5′-CAG GCC AAA ACA CCA TCA TC-3′。GAPDH(311 bp)上游:5′-CCT CTG GAA AGC TGT GGC G-3′;下游 :5′-GGT GGA AGA GTG GGA GTTG-3′。用 TRI reagent以一步法提取各組DC(107)總 RNA,取RNA 2 g進行cDNA合成:70℃、5 min→42℃、60 min→70℃、10 min→冰上;PCR擴增:(1)FasL(33循環)和GAPDH(27循環):94℃預變性 1.5 min→94℃、0.25 min→55 ℃、0.5 min→68℃、1 min→68℃延伸 5 min;(2)Der p2(33循環)和 GAPDH(27循環):將 PCR管置于PCR儀中,95 ℃、4 min→95 ℃、0.25 min→50 ℃、0.5 min→68 ℃、1 min。后3步進行33個循環,PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳1～1.5 h后,圖像掃描,用GAPDH為內參照進行分析。

1.7 Western Blot檢測蛋白表達 用T RI reagent提取各組細胞蛋白質。取蛋白質20 μ g以 10%SDS-PAGE電泳分離;半干電轉移蛋白到PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉,加一抗[兔抗小鼠FasL(1∶500)或小鼠抗Der p2單抗(1∶500)或兔抗小鼠GAPDH(1∶500)]4℃雜交過夜,二抗(HRP標記的羊抗兔IgG或FITC標記羊抗小鼠二抗)室溫孵育1 h,二氨基聯苯胺(DAB)染色。掃描蛋白條帶,以GAPDH為內參照進行分析。

2 結 果

2.1 重組 pIRES2EGFP-Der p2的鑒定 采用 NotⅠ、BstXⅠ雙酶切法和PCR法鑒定重組pIRES2EGFP-Der p2。NotⅠ和BstXⅠ雙酶切后,可得396 bp Der p2片段和4 585 bp線性pIRES2EGFP載體片段(圖1)。以pIRES2EGFP-Der p2質粒為模板,采用 PCR擴增Der p2,可擴增得426 bp的Der p2片段(圖1)。表明 pIRES2EGFP-Der p2構建成功。

2.2 pIRES2EGFP-FasL-Der p2的鑒定 采用雙酶切鑒定和測序法鑒定。NotⅠ和BstXⅠ雙酶切后,可得396 bp Der p2片段和5 440 bp線性 pIRES2EGFP-FasL-Der p2載體片段(圖2);BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后,可得 876 bp FasL片段和4 960 bp線性 pIRES2EGFP-FasL-Der p2載體片段(圖2)。經測序后表明pIRES2EGFP-FasL-Der p2中所含有的Der p2基因和FasL基因與Genbank中的Der p2基因(AF276239)和FasL基因(NM_010177)的編碼區序列完全一致。表明pIRES2EGFP-FasL-Der p2構建成功,Der p2和FasL基因序列完全正確。

圖1 pIRES2EGFP-Der p2質粒酶切和PCR鑒定

圖2 pIRES2EGFP-FasL-Der p2雙酶切鑒定

2.3 pIRES2EGFP-FasL-Der p2重組質粒功能鑒定 FACS檢測表明,第10天培養細胞表達CD11c(DC特異性表面分子)陽性率為79.63%,提示大多數骨髓細胞已分化為DC。

2.3.1 RT-PCR檢測重組質粒轉染DC后FasL和Der p2 mRNA表達 RT-PCR分別檢測轉染48 h后基因轉染DC表達FasL和Der p2 mRNA情況。結果顯示,3組均可見311 bp的GAPDH條帶。pIRES2EGFP-FasL-Der p2轉染DC組(FasL-Der p2-DC)可見明顯的446 bp的FasL條帶和234 bp Der p2條帶(圖3、4),而未轉染DC組、轉染空質粒DC組均未見FasL和Der p2條帶。提示FasL-Der p2-DC能表達FasL和Der p2 mRNA,目的基因FasL和Der p2在FasL-Der p2-DC中能有效地翻譯轉錄。

圖3 pIRES2EGFP-FasL-Der p2轉染DC(FasL-Der p2-DC)的FasL mRNA表達

圖4 pIRES2EGFP-FasL-Der p2轉染DC(FasL-Der p2-DC)的Der p2 mRNA表達

圖5 pIRES2EGFP-FasL-Der p2轉染DC(FasL-Der p2-DC)的FasL蛋白表達

圖6 pIRES2EGFP-FasL-Der p2轉染DC(FasL-Der p2-DC)的Der p2蛋白表達

2.3.2 Western Blot檢測重組質粒轉染DC后FasL和Der p2蛋白表達 Western Blot檢測基因轉染DC中FasL和Der p2蛋白的表達情況。結果表明,各組在36 KD處皆顯現明顯的GAPDH內參照蛋白印跡。未轉染DC組和轉染空質粒DC組無FasL和Der p2蛋白條帶。FasL-Der p2-DC可見明顯的40 KD FasL蛋白條帶和14 KD Der p2蛋白條帶(圖5、6)。提示pIRES2EGFP-FasL-Der p2轉染DC能表達FasL和Der p2蛋白。

3 討 論

FasL分子屬于腫瘤壞死因子家族成員,Fas/FasL介導的T細胞凋亡是機體維持對自身抗原免疫耐受(外周免疫耐受)的重要機制[6]。有研究發現,FasL基因轉染的同種異體DC能夠通過抑制同種混合淋巴細胞反應,從而導致機體對同種異體抗原的低反應性;將FasL基因轉染的供者DC注入受者腹腔后進行異位心血管移植,雖然不能完全阻止排斥反應的發生,但能顯著提高移植物的存活期[7]。FasL基因轉染的DC注入卵蛋白(OVA)特異性Th2細胞誘導的哮喘小鼠體內后可以誘導OVA特異性T細胞凋亡,顯著抑制氣道高反應性和氣道變應性炎癥[8]。表明FasL基因轉染的DC在誘導免疫耐受中有重要作用。

屋塵螨是過敏性哮喘患者常見的過敏原,最重要的是Ⅰ類(Der p1)和Ⅱ類(Der p2)變應原[9]。編碼 Der p1、Der p2質粒DNA疫苗能有效抑制屋塵螨提取液誘導的氣道變應性炎癥[10-11]。將DNA疫苗質粒轉染DC能增強DNA疫苗的治療作用。若DC能同時獨立表達FasL和Der p2,DC在將Der p2抗原呈遞給T細胞的同時,亦將FasL信號傳遞給T細胞,則可能誘導屋塵螨過敏原特異性T細胞凋亡,而誘導抗原特異性免疫耐受,為哮喘的治療提供新的方法。為了使DC能同時獨立表達兩種蛋白,本研究成功構建了FasL和Der p2雙基因共表達的真核載體。

利用基因間以內部核糖體結合位點(internal ribosome entry site,IRES)序列連接構建多順反子載體,其能將多個基因在單一啟動子控制下轉錄形成單一mRNA,避免了在轉錄調控水平對基因表達的影響。IRES元件代替內部啟動子克服了采用啟動子間的相互抑制現象,是近年來多基因共表達載體構建的重要方法[12]。IRES序列來源于某些病毒和細胞的mRNA 5′端的一段非翻譯區,具有內部核糖體結合位點功能[13]。IRES的優點是在上游啟動子的控制下,與IRES相連的非相關基因可同時轉錄成一條單鏈mRNA,但翻譯是各自獨立的,其以不依賴帽的方式啟動遠端mRNA的翻譯,從而在同一轉錄本上翻譯出各自獨立的蛋白[14]。IRES連接的2個開放閱讀框,其轉錄產物在翻譯時核糖體能同時進入并起始翻譯IRES上游和下游的2個轉錄子。其中,IRES上游mRNA的翻譯起始遵循一般的真核生物基因的翻譯起始規律,IRES下游的mRNA的翻譯起始由核糖體直接進入IRES位點后起始翻譯。

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