微小RNA-451對結(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響

吳春蓉,李生陸,羅治彬

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 400010;2.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科 401520)

腫瘤是目前對人類生命和健康危害最嚴重的疾病之一。腫瘤發(fā)生、發(fā)展的確切機制仍未完全闡明,一類新的非蛋白質(zhì)編碼微小RNA(microRNA,miR)的出現(xiàn)為腫瘤研究提供了新的思路。miR是一類長約20～25個核苷酸的非編碼的單鏈RNA分子。它通過與靶mRNA完全或不完全地互補配對,促進目標mRNA降解或抑制蛋白翻譯,在細胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及腫瘤的發(fā)生中扮演重要的角色。研究特定miR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用正成為腫瘤研究的一個新的熱點。

2005年Altuvia等[1]首次發(fā)現(xiàn) miR-451。2009年 Bandres等[2]研究發(fā)現(xiàn)miR-451與預(yù)后不良相關(guān)。與無瘤組織相比,原位雜交顯示胃癌和結(jié)腸癌上皮細胞miR-451表達降低。胃癌細胞AGS和結(jié)腸癌上皮細胞DLD1 miR-451過表達則降低細胞擴增及增加放射敏感性。微陣列及生物信息學(xué)分析鑒別出新的致癌基因巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)是miR-451的潛在靶點。而MIF是參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因子[3-4]。2010年Godlewski等[5]研究miR-451表達對腦膠質(zhì)瘤遷移的影響。球體實驗、劃痕實驗及小室侵襲實驗均發(fā)現(xiàn)miR-451降低球體遷移,深入研究發(fā)現(xiàn)miR-451通過影響細胞骨架而調(diào)控遷移。但miR-451是否影響胃腸癌細胞侵襲能力還未被研究。本課題將化學(xué)合成的miR-451 mimics轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞系SW480細胞,觀察其對結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人源性結(jié)腸癌細胞株SW480(CCL-228,ATCC)為重慶醫(yī)科大學(xué)張貴海博士饋贈。特級胎牛血清購自北京元亨圣馬生物科技公司,新生牛血清購自杭州四季青公司,Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基購自北京邁晨基因公司,轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipofectamine2000(簡稱lipo2000)購自美國Invitrogen公司,Opti-M EMⅠ低血清培養(yǎng)基購自GIBCO公司,細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自碧云天生物技術(shù)研究所,人miR-451 mimics、陰性控制及Cy3標記的轉(zhuǎn)染效率控制購自廣州銳博公司(RiBoBio),Matrigel購自BD Bioseience公司,Transwell侵襲小室(8 μ m 孔徑)購自Millipore公司,細胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細胞均在37℃、無CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng),選用對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 實驗分組:(1)miR-451轉(zhuǎn)染組,加入合成的成熟型miR-451 100 nmol/L(終濃度為100 nM)和相應(yīng)劑量的脂質(zhì)體;(2)Negative組,加入無關(guān)序列和脂質(zhì)體;(3)脂質(zhì)體組,僅加入脂質(zhì)體;(4)對照組,無任何轉(zhuǎn)染。

1.3.1 轉(zhuǎn)染效率檢測 轉(zhuǎn)染前24 h接種SW480于24孔板,待生長至30%～50%匯合時,Opti-MEMⅠ釋轉(zhuǎn)染試劑 li-po2000,另用 Opti-M EMⅠ分別稀釋不同劑量的 siR-RiboTMTransfection Control(Cy3),使轉(zhuǎn)染時終濃度分別為 50、80、100、120 nM;室溫孵育 5 min;將二者輕輕混合,室溫培養(yǎng) 20 min以形成Transfection Control(Cy3)-lipo2000混合物,再加入含有細胞及培養(yǎng)液的24孔板中,輕晃均勻;將培養(yǎng)板置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用熒光倒置相差顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染情況。整個操作過程嚴格遵循RNA操作相關(guān)規(guī)則,并且避光。胎盤藍染色計數(shù)活細胞數(shù)。

1.3.2 miR-451 mimics/Negative轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前 24 h接種SW480于6孔板,待生長至 30%～50%匯合時,取miR-451 mimics/Negative 10 μ L 、脂質(zhì)體 5 μ L,分別經(jīng) Opti-MEM 稀釋至250 μ L,于室溫中作用 5 min后將兩者緩緩混合,靜置 20 min,加入SW480中搖晃混勻。培養(yǎng)6 h后,換含 10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)24～48 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。另設(shè)單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組,未轉(zhuǎn)染細胞做對照組。實驗重復(fù)3次。

1.4 CCK-8檢測腫瘤細胞增殖能力 按照CCK-8試劑盒說明書進行。將SW480細胞按4×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板(每孔100 μ L)中,待細胞貼壁后轉(zhuǎn)染,分別于轉(zhuǎn)染后(24、48、72 h)加入 CCK-8 10μL,37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 2 h,酶標儀測定D450值。每個處理組設(shè)4個復(fù)孔。重復(fù)3次。

1.5 miR-451 mimics對SW480細胞凋亡的影響 用流式細胞儀分析腫瘤細胞凋亡。轉(zhuǎn)染后48 h用胰酶消化細胞,制成單細胞懸液,離心。PBS洗2次后用PBS重懸,充分吹打。調(diào)整細胞密度為1×106個/mL,加入 10 μ L Annexin V-FITC和10 μ L PI,混勻,進行流式細胞儀(BD FACS Vantage)檢測。Annexin V陽性/PI陰性判斷為早期凋亡,Annexin V陽性/PI陽性判斷為晚期凋亡。二者合并計算細胞凋亡率。

1.6 侵襲能力檢測 腫瘤細胞體外侵襲實驗:用50 mg/L基質(zhì)膠(BD公司)1∶4稀釋液包被8 μ m 孔徑 Transwell小室濾膜的上表面,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育 1 h,用 L-15水化小室濾膜上、下表面。消化收集轉(zhuǎn)染后24 h的細胞,離心棄去培養(yǎng)液,用PBS洗 1～2遍,用含0.1%BSA的 L-15培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細胞密度至1×105/mL的細胞懸液。24孔板中放置Transwell侵襲小室,先在小室上層分別加入事先制備好的4組細胞懸液200 μ L,輕輕搖勻。再向下室加入600μL含 10%FBS的L-15培養(yǎng)液。置24孔板于 37℃、無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后從孔板中移出小室,用脫脂棉拭去小室濾膜上層未通過微孔的細胞,將此濾膜先于 4%多聚甲醛中固定 30 min,1%結(jié)晶紫染色10 min,使侵襲到濾膜下層的細胞充分著色呈紫藍色,輕輕洗滌殘余染料,倒置顯微鏡觀察并拍照,每組隨機選擇5個視野,計數(shù)。并重復(fù)實驗3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗重復(fù)3次,所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示,進行正態(tài)性分析及方差齊性檢驗,多組間比較應(yīng)用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加,轉(zhuǎn)染進入細胞的熒光增多,而終濃度為 100、120 nM 時,轉(zhuǎn)染效率都高(約 80%～90%)(見彩插Ⅰ 圖 1)。50、80、100 nM 組死細胞都極少,而120 nM組死細胞增加,提示隨著轉(zhuǎn)染劑量增加,細胞毒性也增加,所以選擇100 nM終濃度為實驗轉(zhuǎn)染miR mimics/Negative的優(yōu)化濃度。

2.2 miR-451 mimics對SW480增殖能力的影響 各組細胞生長曲線較為相似,增殖速度無明顯差別(圖2)。

圖2 miR-451 mimics(100 nM)轉(zhuǎn)染對SW480細胞增殖能力的影響

2.3 miR-451 mimics對SW480細胞凋亡的影響 對照組細胞凋亡率為(5.81±1.20)%,Negative組細胞凋亡率為(9.57±2.92)%,miR-451轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率為(6.33±2.89)%,脂質(zhì)體組細胞凋亡率為(5.60±2.63)%。各組細胞間凋亡發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 細胞侵襲能力 對照組細胞具有一定的侵襲能力,48 h通過8 μ m 孔徑的細胞數(shù)為(33±7)個。miR-451轉(zhuǎn)染組為(17±2)個,Negative組為(29±5)個,脂質(zhì)體組為(31±7)個。Negative組、脂質(zhì)體組侵襲能力與對照組一致,miR-451轉(zhuǎn)染組最低(見彩插Ⅰ圖 3)。

3 討 論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程。包括各種黏附相關(guān)分子、蛋白水解酶類、許多細胞因子及調(diào)節(jié)因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)基因和一些癌基因、抑癌基因等。miR參與對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的基因表達調(diào)控研究已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點。在大多數(shù)高侵襲性的乳腺癌細胞系(如MDA-MB-231)中,miR-126和miR-335表達缺失,通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法恢復(fù)miR-126或miR-335的表達可以使癌細胞的轉(zhuǎn)移活性減少80%。Tavazoie等[6]證明細胞形態(tài)的改變與減少細胞運動性有關(guān),它限制細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。miR-335負調(diào)控組與腫瘤遠端轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因,這些靶基因為祖細胞轉(zhuǎn)錄因子SOX4和細胞外基質(zhì)成分鈣黏蛋白C。Ma等[7]證明 miR-10b的表達與腫瘤的血管侵襲有關(guān),同時miR-10b特異性增加腫瘤細胞的侵襲,但不影響細胞的生活力和增殖。將過表達miR-10b的乳腺癌細胞系SUMl59注射到小鼠乳房脂肪細胞中可以觀察到腫瘤細胞簇的肺部微小轉(zhuǎn)移,并有部分細胞轉(zhuǎn)移到胸膜。Sengupta等[8]應(yīng)用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-29c在鼻咽癌中的表達是正常鼻咽組織的1/5。進一步研究表明,miR-29c調(diào)控的基因為細胞外基質(zhì)蛋白,包括膠原和層粘連蛋白γ1,它們參與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移。miR與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究也備受關(guān)注[9]。影響結(jié)腸癌預(yù)后的主要因素為結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移情況,因此研究與結(jié)腸癌侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的特定miR具有重要意義。

miR-451是一個多功能miR,已被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。最近研究表明,miR-451具有不同的功能,在多種生理和病理過程中(如造血系統(tǒng)分化[10]、血液系統(tǒng)疾病[11]、神經(jīng)發(fā)育[12]、心血管疾病[13]、癌癥發(fā)生等)起重要作用。實驗表明,miR-451在多種惡性腫瘤中(如膠質(zhì)母細胞瘤[14]、胃腸癌[2]、頭頸部鱗狀細胞癌[15]等)異常表達,miR-451還通過靶向MDR調(diào)控卵巢癌[16]、乳腺癌[17]耐藥。

但此前尚未有miR-451與胃腸癌侵襲具有相關(guān)性的報道。2010年Godlewski等[5]研究了miR-451表達對腦膠質(zhì)瘤遷移的影響。球體實驗、劃痕實驗及小室侵襲實驗均發(fā)現(xiàn)miR-451降低球體遷移,深入研究發(fā)現(xiàn)miR-451通過影響細胞骨架而調(diào)控遷移。生物信息學(xué)方法預(yù)測及熒光素酶實驗證實膠質(zhì)瘤細胞中CAB39是miR-451的一個功能相關(guān)靶標。提示miR-451也有可能在胃腸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。因此,本研究對miR-451的功能進行了進一步的研究,通過功能檢測發(fā)現(xiàn),miR-451的表達能夠抑制SW480的侵襲能力。

作者使用siR-RiboTMTransfection Control(Cy3)作為轉(zhuǎn)染效率判斷的間接指標,其與hsa-miR-451 mimics片段大小相似,但是帶Cy3熒光基團,在相同的操作條件下,檢測不同濃度下的轉(zhuǎn)染效率,便于實驗轉(zhuǎn)染mimics篩選有效劑量,mimics組及negative組未帶熒光基團,主要考慮后續(xù)實驗中如流式檢測會帶來干擾。本研究結(jié)果顯示,隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加,轉(zhuǎn)染進入細胞的熒光增多,而終濃度為100、120 nM 時,轉(zhuǎn)染效率都高(約80%～90%)。而120 nM時細胞毒性增加,作者選擇100 nM作為實驗優(yōu)化劑量。

miR mimics是運用化學(xué)方法合成的miR模擬物,能模擬細胞中miR的高表達水平,進一步增強內(nèi)源miR的調(diào)控作用,進行功能獲得性(gain-of-function)研究。本研究通過直接瞬時轉(zhuǎn)染miR mimics對miR-451的功能進行檢測,這種方法的優(yōu)點在于化學(xué)合成miR簡單、快捷,避免了構(gòu)建表達載體的步驟,能夠有效提高特定miR的表達,但缺點是增強表達的持續(xù)時間較短,而且轉(zhuǎn)染后表達量到底增高多少、能持續(xù)多久,還有待于熒光定量PCR檢測。因此,miR-451轉(zhuǎn)染后對細胞增殖和凋亡無影響的實驗結(jié)果尚不能肯定是miR-451確實對SW480細胞增殖和凋亡無影響,還是miR-451表達量太低所致,尚有待于進一步探討。

綜上所述,本實驗利用miR轉(zhuǎn)染技術(shù)提高miR-451在轉(zhuǎn)染細胞中的表達;采用Transwell實驗發(fā)現(xiàn)提高miR-451的表達能夠抑制SW480細胞的侵襲能力。首次發(fā)現(xiàn)了miR-451在結(jié)腸癌細胞系SW480的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,為miR作為靶向腫瘤基因治療的新靶點提供了重要的實驗依據(jù)。但miR-451是通過靶向哪個或者哪些基因而調(diào)控侵襲能力的尚有待于更進一步的探討。對miR及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入理解,以及對miR功能和相關(guān)靶位點的全面闡明必將給未來miR在腫瘤臨床、診斷和治療中的應(yīng)用帶來廣闊前景。

[1]Altuvia Y,Landgraf P,Lithwick G,et al.Clustering and conservation patterns of human microRNAs[J].Nucleic Acids Res,2005,33(8):2697.

[2]Bandres E,Bitarte N,Arias F,et al.microRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells[J].Clin Cancer Res,2009,15(7):2281.

[3]Verjans E,Noetzel E,Bektas N,et al.Dual role of macrophage migration inhibitory factor(MIF)in human breast cancer[J].BMC Cancer,2009,9:230.

[4]He XX,Chen K,Yang J,et al.Macrophage migration inhibitory factor promotes colorectal cancer[J].Mol Med,2009,15(1):1.

[5]Godlewski J,Nowicki MO,Bronisz A,et al.MicroRNA-451 regulates LKB1/AM PK signaling and allows adaptation to metabolic stress in glioma cells[J].Mol Cell,2010,37(5):620.

[6]Tavazoie SF,Alarcón C,Oskarsson T,et al.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis[J].Nature,2008,451(7175):147.

[7]Ma L,Ruya-Feldstein J,Weinberg RA.Tumor invasion and metastasis initiated by micmRNA-l0b in breast cancer[J].Nature,2007,449(7163):682.

[8]Sengupta S,Den-Boon JA,Chen IH,et al.MicroRNA-29c is down-regulated in nasopharyngeal carcinomas,up-regulating mRNAs encoding extracellular matrix proteins[J].Proc Nail Acad Sci USA,2008,105(15):5874.

[9]Bunhu A,Jia HL,Forgues M,et a1.Identification of metastasis-related microRNAs in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2008,47(3):897.

[10]Papapetrou EP,Korkola JE,Sadelain M,et al.A genetic strategy for single and combinatorial analysis of mirna function in mammalian hematopoietic stem cells[J].Stem Cells,2010,28(2):287.

[11]Bruchova-Votavova H,Yoon D,Prchal JT.miR-451 enhances erythroid differentiation in K562 cells[J].Leuk Lymphoma,2010,51(4):686.

[12]Zhang Z,Chang H,Li Y,et al.MicroRNAs:potential regulators involved in human anencephaly[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,42(2):367.

[13]Bostjancic E,Zidar N,Glavac D.MicroRNA microarray expression profiling in human myocardial infarction[J].Dis Markers,2009,27(6):255.

[14]Gal H,Pandi G,Kanner AA,et al.MIR-451 and Imatinib mesylate inhibit tumorgrowth ofGlioblastoma stem cells,Biochem[J].Biophys Res Commun,2008,376(1):86.

[15]Hui AB,Lenarduzzi M,Krushel T,et al.Comprehensive microRNA profiling for head and neck squamous cell carcinomas[J].Clin Cancer Res,2010,16(4):1129.

[16]Zhu H,Wu H,Liu XP,et al.Role of microRNA miR-27a and miR-451 in the regulation of MDR1/P-glycoprotein expression in human cancer cells[J].Biochemical Pharmacology,2008,76(5):582.

[17]Kovalchuk O,Filkowski J,Meservy J,et al.Involvement of microRNA-451 in resistance of the MCF-7 breast cancer cells to chemotherapeutic drug doxorubicin[J].Mol Cancer Ther,2008,7(7):2152.