快速電場起搏對心房肌細胞電生理特性的實驗研究*

王 偉,肖穎彬,程 偉

(第三軍醫大學附屬新橋醫院全軍心血管外科中心,重慶400037)

心房纖顫(房顫)是臨床常見的心律失常,是很多心血管疾病出現的一種表現,其發病率較高。目前對于房顫的病理生理機制尚不完全清楚,導致對于房顫的治療效果欠佳。在房顫的相關研究中,動物模型或臨床病例標本具有諸多局限性[1],所以建立房顫的細胞模型有重要的意義。本研究旨在探索原代心房肌細胞體外培養方法和快速電場起搏模型的建立,并對快速電場起搏后心房肌的電生理特性進行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇1周左右的Wistar乳鼠,雌雄不拘,由第三軍醫大學實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器 BL-420生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司),CO2孵箱,倒置顯微鏡;微電極拉制儀;玻璃微電極:內徑1.6 mm,有芯,長10 cm;阻抗 3～5 MΩ;膜片鉗放大器;心肌細胞灌流及封接監視系統:自制單細胞灌流槽,電視監視系統觀察細胞及指導封接過程;微電極操縱器;分析軟件(德國HEKA公司)。

1.3 主要試劑 DM EM 培養基、胎牛血清、D-hank′s液(Hyclone公司);Ⅱ型膠原酶及5-溴脫氧尿核苷(Brdu,Sigma公司);小鼠抗大鼠Sarcomerie actin單抗(博士德公司);FITC標記山羊抗小鼠IgG(中山金橋公司);用于記錄動作電位的正常細胞外液組成為(mM):137 NaCl,5.4 KCl,1 MgCl2,10 glucose,10 HEPES,以NaOH調pH至7.40;電極內液的組成為(mM):150 KCl,1 M gCl2,5 HEPES,10 EGTA,5 Na2ATP,以KOH調pH至7.20。

1.4 心房肌細胞分離和培養 參考Benardeau等[2]的原代心房肌細胞培養方法并加以改良。消毒后開胸,迅速切除心臟并置于D-hank′s液中清洗、去血,取左、右心房,在手術用放大鏡下仔細去除血管、心房及結締組織,用無血清培養基洗滌,無菌條件下用眼科剪將右心耳修剪成直徑約1 mm大小的組織塊。在組織塊中加入0.08%胰酶,37℃水浴5 min,輕柔吹打,留取上清液加入冷的含15%小牛血清的DMEM中中止消化,反復消化3次。之后向剩余組織中加入0.08%Ⅱ型膠原酶,35～36℃水浴中消化20 min,吹打收集上清液于冷的含15%小牛血清的DMEM中。再重復此步驟2～3次。將每次收集的細胞懸液移入離心管中,4℃1 000 r/min離心5 min,棄上清液,再用 DM EM培養液洗細胞 1次,離心,棄上清液。加入DMEM培養液(含10%胎牛血清),打散細胞團為單細胞懸液。接種于培養瓶中,置培養箱(5%CO2、37℃)中培養45 min后,上清液再培養45 min,用2次差速貼壁法去除成纖維細胞。貼壁后的上清液用臺盼藍染色法計數活細胞數,將其調成細胞濃度為5×105個/mL之后,加入Brdu使其終濃度為0.1 mM,并繼續培養接種于細胞培養瓶內,置 CO2培養箱(5%CO2、37℃)中培養。24 h后換液,加不含 Brdu的DMEM培養液,并用倒置顯微鏡觀察。

1.5 快速刺激心房肌細胞模型建立 采用銅電極片,厚度0.3 mm,長15 cm,寬10 cm,電極間距為10.0 cm,兩電極平行放置,用絕緣體固定,防止兩電極間導電。倒置顯微鏡觀察細胞貼壁80%左右時,在37℃、5%CO2孵箱中將培養板置于電場中用BL-420生物機能實驗系統給予刺激,刺激頻率10 Hz,強度 1.5 V/cm,分別進行電場刺激 6、12、24、48 h。

1.6 心房肌細胞純度的鑒定 用4%多聚甲醛固定20 min,分別做熒光免疫組化。取待用細胞片,0.01 mol/L PBS液洗3次,每次5 min,吹干。以0.1%BSA封閉非特異性反應(37℃水浴30 min),3%H2O2封閉(37℃水浴30 min),細胞片加小鼠抗大鼠Sarcomerie actin(4℃過夜),PBS液洗5 min×3次,加大鼠抗小鼠IgG-FITC(37℃,1 h),熒光顯微鏡下觀察并攝片。陽性細胞率=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.7 全細胞膜片鉗記錄 在全細胞膜片鉗記錄中,采用電壓鉗模式(voltage-clamp mode)記錄離子通道電流;采用電流鉗模式(current-clamp mode)記錄動作電位。取細胞爬片置于倒置顯微鏡工作臺上的1 mL的灌流槽中,以95%O2與CO2混合氣體飽和的細胞外液室溫下灌流,流速1～2 mL/min。于倒置顯微鏡下選擇邊緣整齊、表面無小泡及顆粒、橫紋清晰、無收縮的細胞,在25℃下進行實驗。采用標準細胞貼附式方法,形成高阻封接后,以脈沖負壓破膜。補償電極電容。在電流鉗模式下,以1.5倍的閾上去極化電流刺激引發動作電位,刺激間隔為1 s。連續刺激后,AP形狀較為穩定,連續記錄10個AP,取疊加平均圖形,測量其動作電位復極 50%和 90%時間(APD50and APD90)及有效不應期(ERP)。數據的采集及分析處理由Pulse Pulsefit軟件完成。

2 結 果

2.1 心房肌細胞培養及鑒定 培養72 h,倒置相差顯微鏡觀察見心房肌細胞呈多種形態,以梭狀、桿狀、三角形和不規則形態為主。多數細胞開始出現規律搏動。經免疫細胞化學鑒定,90%以上的細胞Sarcomerie actin染色陽性,細胞純度符合實驗要求。

表1 快速起搏后心房肌細胞動作電位周期和有效不應期的變化(n=6)

2.2 動作電位周期和有效不應期的變化 快速電場起搏6 h后心房肌細胞的APD50和ERP較起搏前無顯著變化,APD90較起搏前顯著縮短(P＜0.05)。快速電場起搏12、24和 48 h后心房肌細胞的APD 和APD 均較起搏前顯著縮短(P＜0.05),ERP較起搏前無顯著變化。結果見表1。

3 討 論

目前對房顫的研究大多是在臨床心肌標本和房顫動物模型上進行,雖然取得了良好效果,但也存在一定的局限性,比如無法進行精確干預、影響因素眾多以及倫理學問題等。隨著心房肌細胞培養技術的成熟與完善,原代培養的心房肌細胞可以作為心肌模型進行心臟疾病病理生理學研究。直接在心房肌細胞上進行研究的結果可靠,所以建立房顫的細胞模型有重大意義[2]。

房顫的發生和維持是一種復雜的病理生理過程,雖然近年來對房顫電重構的離子通道改變進行了深入研究,但學術界仍然對一些現象和理論存在分歧。在目前的研究中,公認心房電重構在房顫的發生發展和維持中具有重要的作用。心房電重構的概念由Wijffels等[3]在1995年提出,指在AF或快速心房率的影響下引起心房肌發生電生理功能改變,并進而促使AF的發生和維持(心房顫動誘發心房顫動)。心房電重構主要表現為心房肌有效不應期和動作電位時程呈進行性縮短,傳導速度減慢,心房肌不應期離散度增加,以及頻率適應性減退等。AF時引起的心房電重構主要與心房肌細胞離子通道、縫隙連接蛋白和腎素、血管緊張素系統的改變有關[4-7]。

本研究利用原代培養的心房肌細胞建立了快速起搏的房顫細胞模型,對快速起搏后的電生理改變進行了初步的研究。結果表明:在快速起搏的 12、24和48 h,心房肌細胞的動作電位周期均較起搏前顯著縮短,提示心房肌細胞發生了電生理變化,與臨床研究和動物實驗取得的結果類似,有效不應期無顯著變化,可能與起搏時間受限有關。分析其電生理變化發生的原因,可能與 L一型鈣通道[8-9]、鉀通道KV4.3等離子通道[10-11]和縫隙連接蛋白[12-13]等的表達改變有關[8],在房顫的電重構過程中,早期主要是由于離子通道自身功能性的反饋調節引起動作電位周期和有效不應期的縮短,后期則通過一系列信號傳導引起L一型鈣通道、鉀通道KV4.3等離子通道基因轉錄和表達下調,導致結構的改變,最終成為維持動作電位周期和有效不應期縮短的物質基礎[14-15]。然而房顫的離子通道基因表達調控機制仍不明確,尚需要進一步的深入研究。

綜上所述,快速電場起搏的原代房肌細胞,電生理改變符合房顫電重構的特點,因此可作為較為理想的房顫實驗研究模型,利用原代培養的心房肌細胞(心房肌細胞或心室肌細胞)建立快速起搏模型,可以得到與快速起搏動物模型相似的效果,但細胞模型更利于進行電生理研究以及進行更精確的藥物干預和分子生物學操作,為房顫的深入研究奠定了基礎。

[1]Bianca B,Harm K,Robert H.Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation[J].Cardiovasc Res,2004,62(3):521.

[2]Benardeau A,Hatem SN,Rucker-Martin C,et al.Primary culture of human atrial myocytes is associated with the appearance of structural and functional characteristics of immature myocardium[J].J Mol Cell Cardiol,1997,29:1307.

[3]Wijffels MC,Kirchhof CJ,Dorland R,et a1.Atrialfibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats[J].Circulation,1995,92(7):1954.

[4]Vicente C,Francisco M,Luis M,et al.Influence of electrical cardioversion on inflammation and indexes of structural remodeling,in persistent atrial fibrillation[J].Int J Cardiol,2009,132(2):227.

[5]Hans-Ruprecht N,Ulrich S,Yuri B,et al.Chronic atrial dilation,electrical remodeling,and atrial fibrillation in the goat[J].J Am Coll Cardiol,2006,47(3):644.

[6]Grace CV,Bernard JG,Teresa SM,et al.Structural and functional remodeling of the left atrium:clinical and therapeutic implications for atrial fibrillation[J].J Am Coll Cardiol,2008,51(1):1.

[7]Antony W,Kathleen K,Andrew R.Cellular bases for human atrial fibrillation[J].Heart Rhythm,2008,5(6):S1.

[8]Manuel M,Shamil Y,Graeme W,et al.Combined metabolomic and proteomic analysis of human atrial fibrillation[J].J Am Coll Cardiol,2008,51(5):585.

[9]Natig G,Mathias B,Guido M,et al.Angiotensin II-induced changes of calcium sparks and ionic currents in human atrial myocytes:Potential role for early remodeling in atrial fibrillation[J].Cell Calcium,2006,39(2):175.

[10]Emanuel F,David R,Kevin D.Information learned from animal models of atrial fibrillation[J].Cardiol Clin,2006,27(1):45.

[11]Hiroshi W,Daniel K,Seiko M,et al.ACE I/D polymorphism associated with abnormal atrial and atrioventricular conduction in lone atrial fibrillation and structural heart disease:Implications for electrical remodeling[J].Heart Rhythm,2009,6(9):1327.

[12]Jyhming J,Yi-Rong C,Chia-Ti T,et al.The association of human connexin 40 genetic polymorphisms with atrial fibrillation[J].Int J Cardiol,2007,116(1):107.

[13]Stefan D,Lioudmila P,Aida S,et al.Pharmacological modulation and differential regulation of the cardiac gap junction proteins connexin 43 and connexin 40[J].Biol Cell,2002,94(7):409.

[14]馬瑞彥,肖穎彬,陳勁進.快速心房起搏對家兔心房肌細胞內鈣離子濃度及L-型鈣通道表達的影響[J].中華醫學雜志,2006,86(27):1926.

[15]Zhao QY,Huang CX,Jiang H,et al.The research of molecular and ionic mechanisms in vagally mediated atrial fibrillation in canine[J].Int J Cardiol,2007,117(3):425.