供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg對心臟移植小鼠體內B細胞功能的影響*

肖 亞,黃赤兵,張艮甫,王平賢,范明齊,馮嘉瑜

(第三軍醫大學新橋醫院泌尿外二科,重慶400037)

由于免疫抑制劑的發展以及配型技術和臨床移植水平的提高,心臟移植近期(術后1年內)效果已顯著改善。然而,迄今為止,尚無阻抑慢性排斥發生和發展的有效藥物與臨床干預手段。在對慢性排斥臨床病例的觀察和實驗研究中,抗原抗體復合物在移植物的沉積和由此介導的內皮細胞慢性損傷是慢性排斥共同的臨床表現[1-3]。因此,欲抑制心臟移植術后慢性排斥,則必須干預B細胞排斥性抗體形成[4]。本實驗擬探討CD4+CD25+Treg體內應用對小鼠心臟移植受體B細胞功能的影響,研究CD4+CD25+Treg在移植術后控制排斥反應,誘導免疫耐受中的作用機制,為推動CD4+CD25+Treg的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要儀器、試劑 Balb/c小鼠30只,雌雄不限,體質量20～25 g。C57bl/6小鼠 30只,雌雄不限,體質量25～30 g,由第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心提供;FITC-labeled Anti Rat CD8、FITC-labeled Anti Rat CD25(美 國Pharmingen公司);抗FITC抗體——磁珠(百奧科生物技術有限公司);免疫磁珠分選(MACS)磁力架、auto MACS磁性分離柱(德國Miltenyi公司);IgA、IgG抗體檢測試劑盒(邁新公司);3H-TdR(中國原子能研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 CD4+CD25+Treg供體抗原特異性的誘導 以0.3%戊巴比妥鈉注射液(1 mL/100 g體質量)腹腔注射將C57bl/6小鼠麻醉,無菌條件下切取小鼠脾臟,將其剪碎,研磨后過200目篩網及400目尼龍網濾器,以小鼠淋巴細胞分離液分離小鼠脾臟單個核細胞,置于含10%BSA的RPMI-1640培養液中備用。無菌條件下切取Balb/c小鼠心臟,制備心組織勻漿抗原。將C57bl/6小鼠脾臟單個核細胞與Balb/c小鼠心臟組織勻漿抗原在37℃、5%CO2條件下混合培養24 h。采用T細胞純化柱分離供體抗原特異性誘導后的Balb/c小鼠脾臟T細胞,以CD8-FITC抗體和抗FITC標記的磁珠相結合陰性選擇法剔除CD8+T細胞,再以CD25-FITC抗體和抗FITC標記的磁珠相結合的陽性選擇法分選獲得CD4+CD25+T細胞,流式細胞儀檢測所獲細胞純度[5]。將細胞濃度調整為2×106/mL,備用。

1.2.2 小鼠心臟移植模型的建立 以Balb/c小鼠為供體,C57bl/6小鼠為受體建立小鼠心臟移植模型,對Chenzh的小鼠頸部異位心臟移植模型進一步改進。方法:在頸總動脈遠心端將其橫斷,向近心端剖開,將此斷端與供心升主動脈吻合,靜脈吻合仍采用端側吻合的方法。建立了小鼠頸部異位心臟移植模型。術后通過視診、觸診及心電圖檢查,觀察移植心搏動情況。移植受體于術前及術后30 min各給予青霉素100萬u/kg各1次,預防感染。術后腹腔注射環孢霉素1.5 mg?kg-1?d-1,連續10 d。

實驗分組:實驗組(n=8),受體于術前 1 d、術后 2周分別經尾靜脈注入供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg各1×106;陽性對照組(n=8),建立小鼠心臟移植模型,術前、術后不給予抗排斥措施;空白對照組(n=8),正常未進行心臟移植的C57bl/6大鼠。

1.2.3 心臟移植受體體內B細胞功能的檢測 于心臟移植術后1個月切取小鼠脾臟,分離單個核細胞,按試劑盒說明檢測血清中IgG、IgA水平。以尼龍毛柱分離獲得小鼠B細胞,將其置于含10%BSA的 RPMI-1640培養液中培養,以IgM抗體刺激B細胞增,培養 72 h后摻入3H-TdR(5 uCi/mL),并繼續培養18 h,以細胞收集儀收集細胞至玻璃纖維膜上,液體閃爍測定cpm值,判斷各組B細胞增殖水平。

1.3 統計學方法 實驗數據采用SPSS12.0軟件進行統計分析。結果以±s表示。統計方法為單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 流式細胞儀檢測供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg純度 經流式細胞儀檢測以免疫磁珠法分離所獲供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg純度為87.3%(圖1),達到實驗要求。

2.2 小鼠心臟移植受體IgG、IgA水平的檢測 正常C57bl/6小鼠外周血IgG水平為(12.58±1.49)g/L,IgA水平為(2.58±0.16)g/L。以Balb/c小鼠為供體,C57bl/6小鼠為受體建立心臟移植模型后,受體在給予CD4+CD25+Treg干預時術后1個月外周血IgG水平為(12.83±1.60)g/L,IgA水平為(2.61±0.23)g/L。受體在沒有CD4+CD25+Treg干預時術后1月外周血IgG水平為(16.81±1.33)g/L,IgA水平為(3.97±0.41)g/L,3組之間差異均有統計學意義(圖2)。實驗結果證實供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg經尾靜脈注入受體大鼠體內后對其體內的B細胞的分泌功能產生了明顯的影響。

圖1 免疫磁珠法分離所獲CD4+CD25-T細胞純度

圖2 各組小鼠脾臟中IgG、IgA水平

2.3 小鼠心臟移植受體B細胞增殖能力的檢測 正常C57bl/6小鼠脾臟B細胞在IgM抗體刺激下培養90 h后cpm值為2 717.39±356.23;以 Balb/c小鼠為供體,C57bl/6小鼠為受體建立心臟移植模型后,受體在給予CD4+CD25+Treg干預時脾臟B細胞在IgM抗體刺激下培養90 h后cpm值為2 351.11±135.09;無CD4+CD25+Treg干預時脾臟B細胞在IgM 抗體刺激下培養 90 h后 cpm值為3 819.80±232.26。3者之間差異有統計學意義(P＜0.05)(圖3)。實驗結果證實CD4+CD25+Treg進入受體體內后對B細胞的增殖能力產生了顯著的影響。

圖3 B細胞體外刺激培養增殖水平

2.4 小鼠移植心臟存活情況觀察 實驗組小鼠移植心臟存活時間為(93.63±14.04)d,長于陽性對照組的(72.38±11.08)d,二者差異有統計學意義(P＜0.05),提示供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg在受體體內能夠特異性地阻斷B細胞對移植心臟的免疫反應,從而達到控制排斥反應程度,誘導免疫耐受,延長移植物存活時間的作用。

表1 實驗組與陽性對照組小鼠移植心臟存活時間(d)

3 討 論

同種器官移植中排斥反應主要由受體的抗原特異性T細胞介導,這些抗原特異性T細胞對移植物不反應或低反應是誘導耐受的關鍵。20世紀90年代初,Qin等[5]發現,采用非清除性抗CD4單抗可使小鼠產生對移植物的耐受,將耐受小鼠CD4+T細胞過繼輸入未移植同品系小鼠,可使其獲得對同基因移植物的耐受,這一過程可連續傳代,表明過繼輸入的CD4+T細胞具有特殊的功能,可使受體針對移植物抗原的T細胞產生耐受,該現象被稱作傳染性耐受(Infectious tolerance)。但并非所有CD4+T細胞均具有傳染性致耐受能力,直到近年,才進一步明確:該類CD4+T細胞是一群CD4+CD25+T細胞,它們通過細胞-細胞直接接觸機制“傳染”抗原特異性的抑制信號給CD4+細胞,使之成為具有抑制功能的Th,抑制受體抗原特異性CD4+T、CD8+T對移植抗原的反應,控制排斥反應[6]。器官移植是挽救終末期患者的有效手段,自20世紀80年代中期,強力免疫抑制劑應用于臨床,急性排斥反應得到了有效的控制。目前在臨床治療中,慢性排斥反應是移植后器官功能喪失的主要原因。因此,探索一條控制慢性排斥反應的治療措施已成為器官移植領域的當務之急。既往的研究證實,抗原抗體復合物在移植組織上的沉積、輕度的細胞性排斥和由此引起的血管內皮細胞損傷與激活,并觸發不適當的修復反應等[1-3]是引起慢性排斥反應的主要機制。其中由移植物抗原刺激啟動的體液免疫應答生成抗體并由此而形成的抗原抗體復合物,與通過激活補體和抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用,是導致慢性排斥反應發生的最主要致病因素。B細胞是機體惟一的抗體形成細胞,所以欲控制慢性排斥反應的主要致病因素——體液免疫應答,則必須調控體液免疫的主要功能執行細胞——B淋巴細胞[7-10]。迄今,國內外在這方面采取的干預措施有:利用特異性的單克隆或多克隆抗體阻斷受體本身的排斥性抗體與移植物抗原的結合,或阻斷清除受體排斥性B細胞等[8]。但這些措施由于有效靶阻率很低、費用昂貴,且不良反應很多,因此沒有成為也夠不上調控慢性排斥反應的理想的常規應用手段。

在前期實驗中證實,體外淋巴細胞混合培養中,與CD4+CD25+Treg、供體淋巴細胞混合培養時B細胞功能可明顯受到抑制,表現為細胞培養上清中的IgG、IgA水平明顯降低。進一步的研究證實CD4+CD25+Treg對效應性B細胞的抑制作用主要是通過細胞間直接接觸機制發生作用,TGF-β1和CTLA4在這一機制中起著一定作用。以供心臟組織勻漿抗原刺激可使受體CD4+CD25+Treg獲得供體抗原特異性,其抑制效應性淋巴細胞對供體抗原的反應能力明顯增強,而不影響效應性T細胞對第3方抗原的免疫應答[9]。CD4+CD25+Treg細胞具有負調B細胞抗體形成的這一免疫學特性,使其具備了對抗慢性排斥反應的潛能。基于以上實驗結果,作者推測采用供體特異性的CD4+CD25+Treg細胞體內應用,可選擇性阻抑受體內的供體反應性B細胞,從免疫應答起始階段阻斷供體反應性B細胞產生供體抗原特異性抗體,而不造成對受體免疫功能的進一步阻抑,從而達到控制慢性排斥反應的理想狀態。在本實驗中,在體使用了供體抗原特異性的CD4+CD25+T reg,從實驗結果可以看出,小鼠心臟移植受體應用供體抗原特異性CD4+CD25+T reg后,其外周血血清中 IgG、IgA水平與空白對照組比較差異無統計學意義,二者均明顯低于陽性對照組,提示體內應用的供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg特異性地阻斷了B細胞對移植心臟的免疫反應。體外刺激實驗進一步證實供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg在體應用后B細胞的增殖活性明顯降低。

本實驗驗證了供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg在體應用后對B細胞的特異性免疫抑制作用,進一步闡明Treg細胞對抗慢性移植排斥反應的免疫學機制,為推動抗移植后慢性排斥反應的深入研究和對開發利用Treg細胞作為介導其他實體器官移植耐受的臨床應用工具細胞鋪墊理論、應用和實驗支持基礎。

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