15-脫氧前列腺素J2在大鼠缺氧性神經細胞損傷中的作用*

裴麗春,張一娜,張震環,劉美玲,韓 晶,張艷橋

(哈爾濱醫科大學:1.附屬第二臨床醫學院老年病科,哈爾濱150081;2.附屬第三臨床醫學院內八科,哈爾濱150081)

腦卒中是許多發達國家致死和致殘的主要原因。在中國,腦血管疾病是第3位致死因素,其中缺血性腦梗死占56.6%～80%,致殘率占第1位。在以前的研究中發現環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)參與了缺氧性神經細胞損傷死亡的病理過程[1],過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPA R-γ)參與了缺氧缺血后神經細胞損傷死亡的病理過程[2]。環氧合酶-2的代謝產物 15-脫氧前列腺素 J2(15d-PGJ2)是 PPAR-γ的天然配體[3],本實驗通過使用缺氧再復氧裝置,處理原代培養的大鼠皮質神經細胞,旨在探討 15d-PGJ2在大鼠缺氧神經細胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 使用的原代培養的大鼠皮質神經細胞來自于新生24 h以內的Sprague-Dawle大鼠的乳鼠,所有實驗動物均由哈爾濱醫科大學附屬第二臨床醫學院動物中心提供。實驗分別設對照組(未處理組)、缺氧再復氧組、不同濃度15d-PGJ2處理的缺氧再復氧組。

1.1.2 試劑 Neurobasal A、B27購自 Life Technologies Inc(Rockville,M D),15d-PGJ2購自Cayman Chemical Company。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠皮質神經細胞的原代培養 無菌條件下取出生24 h內的乳鼠放入75%的乙醇中消毒1～2 min后,用眼科剪刀迅速剪下鼠頭部,用冰 D-Hank′s液沖洗,剪開顱腔,取出全腦,剝離皮層,仔細去除血管和腦膜。用手術剪刀將組織剪碎至1～3 mm大小。加入3～5倍體積的0.25%胰酶溶液,37℃水浴消化30 min,加入10%DMEM培養液終止消化,800 r/min離心5 min,棄上清液。加入10%DMEM培養液,用吸管輕輕吹打制成細胞懸液,靜止后吸取上清液過200目不銹鋼篩網。用10%DMEM培養液調細胞數為5×106/mL,接種至直徑為35 mm培養皿中,每個培養皿2 mL。37℃、5%CO2培養。24 h后換維持含Neurobasal A、B27的培養液,以后每3天半量換液。接種3 d時加入終濃度為 5～10 μ mol/L的阿糖胞苷以抑制膠質細胞的生長。此方法培養的大鼠皮質神經細胞經鑒定證實95%為神經元。

1.2.2 神經細胞缺氧再復氧模型制備及分組 取培養第12天的皮質神經細胞,隨機分成3組,即空白對照組(未處理組)、二甲基亞砜(DMSO)對照組、15d-PGJ2+缺氧再復氧組(缺氧前 30 min 分別加入 0、1、5、10、25、50 μ mol/L 15d-PGJ2),然后置于缺氧罐(95%N2,5%CO2)內,37℃培養箱中孵育2 h后,將神經細胞返回到37℃、5%CO2的細胞培養箱中再復氧21 h。

1.2.3 M TT比色法測定神經細胞生存情況 取培養第12天,生長在96孔培養皿中的原代培養的神經細胞,不同分組處理后,將125 mg/mL的噻唑藍(M TT)40 μ L加入到每個孔中,37℃避光培養4 h后,每孔中加入 DMSO 150 μ L,振蕩 10 min,置于酶標儀492 nm檢測吸光度A值,結果以對照組生存率的百分比表示。

1.2.4 DNA凝膠電泳法檢測神經細胞凋亡情況 培養第12天,生長在100 mm培養皿中的原代培養的神經細胞,經不同分組處理后,細胞用預冷的磷酸鹽緩沖液洗滌1次,置于含有10 mmol/L Tris-鹽酸(pH=7.4),10 mmol/L EDT A及0.5%TritonX-100裂解液中裂解,超速離心,使用碘化鈉及乙醇在上清液中沉淀DNA,提取出的DNA在含1%～2%溴乙啶的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳,DNA被溴乙啶著色,最后在紫外線燈下攝影,觀察凋亡的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中所出現的梯形裂解條帶情況。

1.3 統計學方法 所有影像用Scion Image軟件量化處理,統計學分析使用Statview軟件的單因素方差分析(One-way ANOVA),以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 神經細胞的原代培養 培養的皮質神經細胞接種1 h內開始貼壁,絕大多數是單個分散的細胞。3～5 h細胞開始變平,并且長出突起。3 d后細胞胞體清晰明亮、豐滿、呈現錐體或星形;經細胞突起生長并形成網絡。培養1周后,神經細胞胞體進一步增大,突起增粗并出現分支,此時神經細胞已接近成熟,成熟神經細胞邊界清楚,在倒置顯微鏡下可見明顯暈光(圖1)。培養2周后,神經細胞網絡連接緊密,形態更加飽滿,可以應用于實驗研究(圖2)。

圖1 皮質神經元細胞(培養1周,×100)

2.2 神經細胞特性鑒定 應用抗神經元特異性烯醇化酶(NSE)抗體對原代培養10 d的神經細胞進行免疫 FRTIC標記熒光實驗,每個樣本隨機選擇3個視野,分別計數200個細胞,判定原代培養神經細胞中神經元細胞和神經膠質細胞所占的比率。NSE抗體在培養的皮質神經細胞中的表達情況(圖3),其中在熒光顯微鏡下觀察呈現紅色熒光的即為 NSE陽性細胞,即神經元細胞。結果為培養的皮質細胞中 NSE陽性細胞(即神經元細胞)占細胞總數的98.9%,提示原代培養的神經細胞中所含的神經元細胞數量完全能滿足實驗的需要。

圖2 皮質神經元細胞(培養 2周,×100)

圖3 NSE抗體在神經細胞中表達(×100)

2.3 15d-PGJ2對神經細胞生存率影響的劑量反應曲線 培養第12天的皮質神經細胞,給予不同濃度15d-PGJ2處理30 min,給予缺氧2 h再復氧21 h處理,使用M TT測定法測定神經細胞生存率。結果可見,外源性15d-PGJ2在1～5μ mmol/L(低劑量)沒有明顯的保護神經細胞的作用,而10 μ mmol/L(高劑量)以上則具有劑量依賴性保護神經細胞的作用,神經細胞生存率的上升情況在15d-PGJ2處理組與未處理組間比較差異有統計學意義(P＜0.05,P＜0.01)(圖4)。

圖4 外源性15d-PGJ2對神經細胞生存率影響的劑量反應曲線

2.4 15d-PGJ2對神經細胞損傷作用研究結果 給予培養第15d-PGJ2預處理 30 min,再予以缺氧2 h再復氧21 h處理,用DNA凝膠電泳法檢測DNA核小體間斷裂情況。結果顯示,缺氧再復氧處理組皮質神經細胞出現典型的DNA梯形裂解條帶,而15d-PGJ2預處理組皮質神經細胞DNA的斷裂情況明顯減輕(圖5)。

圖5 DNA凝膠電泳法檢測神經細胞凋亡情況

3 討 論

腦血管疾病特別是缺血性卒中占長期致殘疾病的第1位,嚴重威脅人類健康。對缺血性神經細胞損傷的研究,一直以來是學術界研究的熱點。本研究在體外原代培養乳鼠神經細胞中使用缺氧再復氧模型,模擬體內缺血再灌注損傷,并應用15d-PGJ2進行干預。實驗結果表明,15d-PGJ2在高劑量時具有劑量依賴性的保護神經細胞的作用,且15d-PGJ2預處理組皮質神經細胞DNA的斷裂情況明顯減輕。提示15d-PGJ2對神經細胞缺氧性損傷起保護作用。

目前發現環氧合酶(cyclooxygenase,COX)有2種亞型:COX-1和COX-2。COX-2是花生四烯酸代謝中的關鍵限速酶,將花生四烯酸轉變為前列腺素H2(PGH2)[4-5],隨后在不同酶的作用下分別生成 PGE2、PGI2、PGD2、PGF2a和 TXA2等。15d-PGJ2是由前列腺素D2(PGD2)在體內迅速通過脫水產生的具有的生物活性的 J2類的前列腺素。有資料表明15d-PGJ2對腦缺血具有保護作用[6]。15d-PGJ2能明顯減少細胞凋亡,減少由于腦出血引起的炎癥、行為障礙、神經元的丟失,促進過氧化氫酶的表達[7]。15d-PGJ2保護腦組織免于缺血再灌注損傷[8]。15d-PGJ2對脊髓損傷起保護作用[9]。血清15d-PGJ2濃度的升高使近期與遠期的神經功能缺損相對輕于濃度低者,且梗死面積相對較小,15d-PGJ2對卒中患者起保護作用[1]。本實驗在體外建立的神經細胞缺氧再復氧模型上驗證了15d-PGJ2具有劑量依賴性保護神經細胞免于缺氧導致的死亡的作用,而且能減輕神經細胞凋亡。因此,推斷15d-PGJ2參與了神經細胞死亡的病理過程。

但有關15d-PGJ2是通過何種機制達到保護神經細胞的作用機制迄今仍不清楚,有實驗表明,15d-PGJ2能與PPAR-γ結合而影響著許多基因的轉錄而作用細胞周期[11]。但也有實驗表明15d-PGJ2可能通過非PPAR-γ途徑對卒中起保護作用[12]。另有實驗表明15d-PGJ2可能通過阻止小神經膠質細胞活化和炎性細胞因子的表達起到神經保護作用[13]。對15d-PGJ2是通過何種機制達到保護神經細胞的相關研究有待進一步深入。

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