鈣結合蛋白與皮質發育不良*

黃 敏 綜述，晏 勇審校

(重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科 400016)

皮質發育不良(cortical dysplasia，CD)是各類腦發育畸形的總稱，包括神經元異位(結節狀異位、雙皮質)、無腦回、巨腦回、多微腦回和腦穿通畸形、胼胝體發育不良或缺失等多種類型。其發病機制復雜，從胚胎期至成年期以前大腦發育過程中受到內外環境中有害因素的干擾或損害都可引起大腦皮質發育紊亂，臨床以癲癇發作、發育遲緩、智力障礙等為主要表現[1-3]。在兒童難治性癲癇(intractable epilepsy，IE)患者手術腦組織的病理檢查中發現CD約占40%，提示CD常見且和IE密切相關。近年的研究提示小清蛋白(parvalbumin，PV)、鈣視網膜結合蛋白(calretinin，CR)、鈣結合蛋白 D-28k(calbindin-D28k，CaBPD28k)可作為研究CD的層特異性標志物(layerspecific markers，LSMs)，并特異地表達于 GABA(r-aminobutyric acid，GABA)能中間神經元的亞群[4]。而癲癇的發生和GABA能神經元的損傷密切相關，因此，最近研究CD及其所致IE的病理生理機制中，有關 PV、C R、CaBPD28k的報道越來越多。本文就此方面的研究進展作一綜述。

1 PV、CR和CaBPD28k的生物學特性

鈣結合蛋白(calcium binding protein，CaBP)是一組具有E-F手形(E-F hand)保守結構的酸性蛋白超家族，能與鈣離子高選擇地結合，以多拷貝形式存在于細胞內，該家族包括Calbind-D28k、Calretinin、Calpain、Calci-neurin 等 200 多種蛋 白質，分激發型、緩沖劑型兩大類。鈣調蛋白是激發型蛋白的一種，能與鈣離子結合后迅速扭轉變形，進而結合靶分子以調節其活性;Calbindin-D屬于緩沖劑型，可參與細胞內鈣離子濃度的調節。其中，PV、CR和CaBPD28k是3種重要的鈣結合蛋白，在中樞神經系統中表達豐富，并且在神經系統發育的不同階段，其表達含量有所變化，具有多種重要的生理功能。

1.1 PV、CR和CaBPD28k的結構特點 PV是含有 6段α螺旋的小蛋白，其中CD和EF4段螺旋分別為2段環形的小肽連接，構成了螺旋-環-螺旋類型的超二級結構。2個鈣離子結合在環區，而環區兩側的螺旋間的相對取向類似于人手伸展開時相互垂直的拇指和食指，這樣的超二級結構被稱為E-F手形。CR是一種在細胞內結合鈣離子的蛋白，它的相對分子質量為31.5×103，屬于具有E-F手形模序的肌鈣蛋白 C超家族。CaBPD28k首先從禽類腸道中分離出來，是存在于真核細胞胞漿的維生素D依賴性的可溶性鈣結合蛋白，維生素D及其代謝產物可對其活性進行調節，它的相對分子質量為28×103，由261個耐熱酸性蛋白氨基酸殘基組成多肽鏈，具有E-F手形，呈螺旋環狀結構，由6個不同的螺旋狀鈣離子結合亞基組成單一球狀蛋白[5]，是維持細胞正常生長發育所必需的蛋白質。

1.2 PV、CR和CaBPD28k在人類大腦皮質中的表達 在胚胎發育的第8～24周，側腦室周圍的神經祖細胞經有絲分裂形成的神經元經過側腦室壁向外移行，形成軟膜下前皮質板。隨后產生的神經元遷移到前皮質板中將其分為表層的分子層和深部的皮質下板。后續產生的神經元陸續通過皮質下板和皮質板遷移到皮質第Ⅰ層下，先發育成熟的神經元移行至皮質深部，后發育成熟的神經元移行至皮質淺層，從而形成6層皮質結構。這種移行方式稱為“內側外翻”模式。

在人類胚胎發育的第21～25周，大腦皮質中開始出現CR免疫陽性細胞，主要位于皮質Ⅱ、Ⅲ層，CR免疫陽性細胞一般為雙極、雙束及卡扎爾(Caja1)星形細胞。PV免疫陽性細胞在胚胎中出現的時間較晚，一般為32～36周，主要位于皮質深層。在成人皮質，PV分布于除Ⅰ層外的所有皮質層，主要位于第Ⅳ層，其層特異性不如CR明顯。PV免疫陽性細胞最具特征性的是大籠狀或樹枝狀細胞。CaBPD28k免疫陽性細胞也出現在胚胎期的 32～36周，主要位于皮質Ⅱ、Ⅲ層，在成人主要位于第Ⅱ層，免疫陽性細胞一般為雙束細胞。由此可見，PV、CR、CaBPD28k的表達具有較強的時空性，即在腦發育的不同時期和不同皮質區域，表達量有所不同，但成年后其表達部位和含量趨于穩定，提示其參與了某些階段的神經系統發育且具有層特異性分布的特征。因此，研究其在神經系統中的作用和功能時，需要考慮年齡和結構等因素對其產生的影響。

1.3 PV、CR以及CaBPD28k在中樞神經系統中的作用PV、CR、CaBPD28k在中樞神經系統中含量豐富，具有多種重要的生理功能。其中，CaBPD28k的生理功能研究較多，PV和C R的研究相對較少，但研究表明，PV、CR以及CaBPD28k是3種重要的鈣結合蛋白，在神經系統活動中至關重要。其主要功能:(1)與細胞內鈣離子結合，作為鈣離子的儲存庫，緩沖鈣離子濃度的流向，調節鈣依賴系統的功能，從而參與信息傳遞。(2)作為載體蛋白，參與細胞內鈣的轉導。(3)預防鈣超載，通過對Ca2+緩沖、運輸、激活細胞內與Ca2+相關的多種酶活性的作用，使細胞免受鈣離子濃度過高而引起的毒性作用，使神經元對興奮毒性有更持久的耐受性，具有重要的神經保護功能，有利于神經元持續點燃[6]。(4)PV、CR和 CaBPD28k分別表達于中樞神經系統中特定的GABA能抑制性中間神經元的亞群，互不重疊，這3種亞群構成了全部的GABA能神經元，而GABA能神經元可以合成和釋放經典的抑制性神經遞質γ-氨基丁酸，與癲癇等疾病的發生密切相關。(5)PV、CR和CaBPD28k的層特異性及細胞特異性分布特點可用來標記腦發育中一些皮質構筑特點和神經元回路，是 3種重要的LSM s[7]，通過檢測其免疫陽性神經元的分布，有助于CD的診斷、分類和病理生理機制的研究。(6)它們能改變細胞膜上鈣通道蛋白的活性，選擇性提高細胞膜對鈣離子的攝取。(7)CaBPD28k能作為鈣敏感調節蛋白，通過與鈣轉運系統的其他分子如鈣調素(CaM)、骨鈣素(OC)等的協同作用，參與酶的激活，從而激活一系列其他的細胞內反應，如堿性磷酸酶;并可激活Mg2+、ATP酶等;通過結合并抑制細胞凋亡蛋白酶3(caspase-3，CPP3)的活性，防止大腦結構紊亂或形成有破壞性的斑塊等(這些都是神經退行性疾病的標志);CaBPD28k還可進入細胞核，可能參與某些基因的活性調節。

2 PV、CR和CaBPD28k與CD的關系

與在嚙齒類動物中的研究發現一樣，許多LSM s在靈長類動物中屬于同一分子家系，如鈣結合蛋白[8-9]。CR、CaBPD28k能標記皮質Ⅱ、Ⅲ層的中間神經元，其層特異性比較明顯。PV的層特異性不如前兩者顯著，但它聯合囊泡膜谷氨酸轉運體3(vesicular glutamate transporter3，VGLUT 3)、神經肽 Y(neturopetide，NPY)和生長抑素(somastatin)等標記物可用來標記多種不同類型的中間神經元，具有明顯的細胞特異性分布。孕17 d母鼠腹腔注射甲基氧化偶氮甲醇(methylazoxymethanol，MAM)可導致子代鼠的CD，研究發現這些CD大鼠海馬的PV陽性細胞減少[10];Ramona等[11]在用卡莫司汀建立的大鼠CD模型中，通過免疫組化染色發現其大腦皮質PV陽性細胞的空間分布和細胞形態均出現異常;Lurton等[12]研究 Taylor′s型局灶型CD患者大腦病灶的組織病理學和免疫組化時發現，PV免疫陽性著色出現在Ⅳ～Ⅴ層皮質的中間神經元和纖維中，PV免疫陰性的氣球樣細胞被陽性著色的纖維末端包繞形成籃狀結構(basket)。Thom等[13]發現人類局灶型皮質發育不良和微小型皮質發育不良患者手術標本中，PV、CR和CaBPD28k免疫陽性的中間神經元減少，并出現了肥大或多極的鈣結合蛋白免疫陽性的細胞。Zamecnik等[14]也發現在人類微小型皮質發育不良和Ⅰ、Ⅱ型局灶性皮質發育不良中，PV免疫陽性細胞分別減少了72.4%、55.0%、12.2%，在ⅡA和ⅡB型皮質發育不良中PV免疫陽性神經元的密度也不同，微小型皮質發育不良的顆粒下層中PV免疫陽性神經元數量顯著降低。同樣，Liu等[15]也發現在局灶型皮質發育不良患者病灶手術標本中，PV陽性神經元和纖維排列明顯分散，PV陽性的中間神經元的數量減少，染色程度變淺，在Ⅱ型局灶性皮質發育不良中尤其明顯。X染色體連鎖的無腦回畸形伴外生殖器異常中，Okazaki等發現CR免疫陽性的細胞數量減少并出現神經元異位，異位神經元在白質和新皮質室下區也有出現。

這些研究主要通過組織病理學技術觀察，先從形態學上大致確定皮質發育是否正常，再通過PV、C R和 CaBPD28k的免疫組化檢測觀察其陽性細胞的空間分布情況，與正常對照組比較，進一步證實CD的存在并進行分類。皮質發育障礙中，普遍存在PV、CR和CaBPD28k免疫陽性細胞數量的減少以及空間分布的紊亂。越來越多的研究提示，PV、CR和 CaBPD28k能標記特定神經元的亞群并標記皮質發育中大腦一些臨時性構筑特點和神經元回路，可以作為鑒定CD的層特異性標志物。通過對其層特異性以及細胞特異性表達情況的觀察，有助于為CD的診斷、分類以及CD中神經元的發生、增殖、分化以及遷移的研究提供更多的理論依據。并且，相對于其他的層特異性標志物，鈣結合蛋白在對人類皮質發育的研究中具有特殊的用途，因為這些抗原對于抗自溶、甲醛固定、石蠟包埋等相對穩定，對腦組織的免疫組化分析更為合適[16]。

3 PV、CR和CaBPD28k與CD所致難治性癲癇的關系

Garbelli等[17]發現人類型CD所致的難治性癲癇患者的手術腦組織標本中PV免疫陽性中間神經元的密度顯著降低，他們推測此型CD中PV低表達導致GABA能系統功能損害可能是癲癇發生的重要機制。André等[18]發現繼發于Ⅰ型和Ⅱ型皮質發育不良的癲癇患者的手術腦標本中GABA能中間神經元數量、體積均出現改變，提示GABA能系統抑制功能降低可能在CD導致的癲癇中起了重要作用。Zamecnik等[19]也發現CD致癲癇患者的病灶中有斑片狀的PV免疫陽性細胞缺失區。有研究表明在CD所致的難治性癲癇患者腦白質內，異位神經元體積增大且被PV免疫陽性的藍狀結構包繞。皮質發育障礙區和鄰近的正常區域比較，興奮性和抑制性突觸的密度、比例都有改變，說明CD導致興奮性和抑制性突觸環路的改變可能與癲癇有關[20]，局部環路神經元的形態和分布異常在局灶性皮質發育障礙導致的局灶型癲癇放電的發布、延長以及持續運動信號的產生中可能有重要作用。Stacey等[21]研究端腦內部結構異位的大鼠(一種新皮質畸形的對癲癇敏感的遺傳模型鼠)時發現在提痧皮質(tisha cortex)中異位和位置正常的神經元都出現了膜電位減低和輸入阻抗增高，并出現了GABA能突觸傳遞減弱，尤其是自發的抑制性突觸后電流(inhibitory postsynaptic current，IPSCs)顯著降低，IPSCs 的振幅也減小，而位置正常的神經元的抑制性神經支配的顯著減弱與表達PV的GABA能中間神經元亞群的減少密切相關，說明抑制性GABA能中間神經元的神經傳遞被擾亂是癲癇發作的重要原因，進一步提示皮質發育不良使癲癇的發生閾值降低。Cai等[22]為了探討局灶型皮質發育障礙所致癲癇的患者發作間期癲癇樣放電(interictalepileptiform discharge，IED)與組織病理學改變之間的關系，通過長時程的視頻腦電圖檢測將患者的IEDs分為4種類型，對手術切除的致癇區通過細胞免疫化學進行PV半定量評分，發現表現為棘波類型患者的PV得分高，為8分;多棘波亞型為5.6分，并且，局灶性皮質發育障礙的嚴重程度不同，病理表現不同，IEDs也不同。因此，他們推測PV得分高意味著成為致癇區的可能性低。

GABA能抑制性神經元是中樞神經系統中重要的中間神經元，能合成和釋放經典的抑制性神經遞質γ-氨基丁酸，在神經系統的抑制活動中起主要作用。鈣結合蛋白中的PV、CaBPD28k具有神經保護功能。GABA能抑制性中間神經元數量減少、空間分布改變、形態異常等均可導致局部神經網絡異常，都能使其對興奮毒性的保護作用降低，使新皮質錐體神經元的抑制性功能受到損害[23]。

4 結 語

鈣結合蛋白PV、CR和CaBPD28k特異地表達于GABA能抑制性中間神經元的亞群，且具有大腦皮質的層特異性特征，隨著其測定方法的不斷完善，結合皮質神經元的解剖、生理特征，有望成為臨床上診斷CD的客觀、準確的檢測指標。與其他層特異性標志物一起作為CD神經病理學診斷的特異性免疫組化探針，揭示皮質發育的機制、皮質環路結構和功能，闡明CD的致癇機制。但是，目前研究還剛剛起步，很多問題尚未明確，如大腦在發育的不同時期、腦皮質不同部位其表達含量和分布存在的差異，研究者如何排除這些因素，在活體中如何準確檢測其表達含量，闡明其致IE的具體機制等等?？上驳氖?，隨著神經發育學的發展，研究者除了采用逆行標記、免疫組化、免疫熒光、激光共聚焦等一般研究方法之外，還可用采用單細胞RT-PCR研究、原位雜交以及微陣列分析、DNA數據庫等分子生物學方法對其進行研究。相信在不久的將來，類似的層特異性標志物的研究將會為CD以及中樞神經系統其他疾病的研究開辟更加廣闊的前景。

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