膠原蛋白化學交聯(lián)技術的研究進展*

崔運利綜述，楊 柳審校

(第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院關節(jié)外科中心，重慶 400038)

膠原蛋白具有能夠形成高強度的不溶性纖維、低免疫原性等特點[1]，這些特點使其成為構建組織工程軟骨支架較為理想的材料，但單純以膠原蛋白為材料所構建的組織工程支架，其降解速度較快，強度也比較差，不能達到作為種子細胞支架的要求。因此，需要對膠原蛋白進行改性以提高支架的性能。許多實驗證明，應用物理和化學交聯(lián)劑等改性膠原蛋白的方法均可以使膠原蛋白支架在強度和抗水解能力等方面明顯提高。其中使用物理交聯(lián)法可以避免外源性有毒物質進入膠原蛋白內造成影響，但是物理改性膠原蛋白的方法交聯(lián)度很低，且常常使交聯(lián)的材料發(fā)生變性和一些不明確的不良反應，因此，常作為輔助方法?；瘜W交聯(lián)法可以使膠原蛋白支架性能明顯提高，而且用于交聯(lián)的化學交聯(lián)劑種類多，但化學交聯(lián)劑本身或其反應產物常常具有細胞毒性等不良反應，或者其交聯(lián)條件非常苛刻，使得每種化學交聯(lián)劑在實際的應用中都或多或少存在一定的局限性。因此，在實際的應用中，應根據(jù)實驗目的，把上述諸多因素考慮進來進行化學交聯(lián)劑的選擇?？傊?，無論使用哪種交聯(lián)劑進行交聯(lián)，理想的交聯(lián)效果應是交聯(lián)后的膠原蛋白具有良好組織相容性，對接種在其上面的種子細胞無任何不良反應，并且交聯(lián)后的膠原蛋白在耐熱性能、變性溫度、抗水解能力、力學強度方面均能有所提高，同時減慢膠原酶的降解速度和降低其遇水膨脹度。

1 化學交聯(lián)法

1.1 醛類 戊二醛(glutaraldehyde，GTA)是帶有刺激性氣味的無色透明油狀液體，在組織工程中應用較早且十分常用的一種化學交聯(lián)劑，它可以明顯提高交聯(lián)后膠原蛋白支架的強度和解鏈溫度，有較好的交聯(lián)效果，并且價格低廉。GTA的作用機制是與膠原蛋白中的自由氨基反應形成化合物。Chajra等[2]應用GTA與EDC/NHS交聯(lián)膠原蛋白并對它們的交聯(lián)效果進行對比，發(fā)現(xiàn)使用GTA交聯(lián)的膠原蛋白海綿支架強度比用EDC/NHS交聯(lián)的效果好，而且用GTA交聯(lián)的膠原蛋白海綿支架的羥基磷灰石含量更適合骨軟骨的修復。然而，雖然GTA能提供有效交聯(lián)，明顯改善膠原蛋白支架的機械性能，但大量研究證實GTA有明顯的細胞毒性，少量的GTA殘留就會對其周圍的細胞產生不良反應，且GTA具有變應原性特性。因此，目前已較少作為交聯(lián)劑應用于組織工程，由于其有較好的交聯(lián)效果，常作為其他交聯(lián)劑交聯(lián)效果好壞的對照。

1.2 異氰酸鹽類 1，6-己二異氰酸酯(hexamethylene diisocyanate，HDI)是一種脂肪族的雙官能團異氰酸酯，為透明無色液體，稍有刺激性氣味，也可以用作膠原蛋白的交聯(lián)劑，并且有較好的交聯(lián)效果。Naimark等[3]用H DI對膠原蛋白進行交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)HDI交聯(lián)能顯著提高膠原蛋白的機械性能，并且同時還可降低鈣化度。但 Luyn等利用甲基纖維素培養(yǎng)系統(tǒng)對HDI的細胞毒性進行研究，發(fā)現(xiàn)有中度細胞不良。因此，由于異氰酸鹽類具有明顯的細胞不良反應，近年在組織工程支架應用中用其來改性膠原蛋白的研究已經很少，但如果使用HDI進行膠原蛋白交聯(lián)，應該使用有效的清洗方法來去除對細胞有不良反應的物質。

1.3 京尼平(genipin) 是從梔子果實中提取的活性化合物，性狀為白色晶體，是一種很好的膠原蛋白和殼聚糖的天然交聯(lián)劑，目前，京尼平在生物組織和生物材料等方面應用較多，很多文獻報道應用京尼平對膠原蛋白進行交聯(lián)可以在機械強度方面獲得較好的效果[4-7]。通過一些鼠和犬的實驗證實京尼平的細胞毒性極低，而且應用京尼平所固定的產品具有良好的組織相容性，京尼平是一種與GTA交聯(lián)效果相當?shù)慕宦?lián)劑，而且其細胞毒性遠遠低于GTA。Sundararaghavan等[8]應用京尼平來改性膠原蛋白凝膠，并且對不同濃度的京尼平對細胞的影響做了研究，發(fā)現(xiàn)經過京尼平改性后，其機械性能明顯提高，但京尼平的凝聚物應小于5 m M，否則，將會對細胞產生毒副作用。Ko等[9]利用京尼平交聯(lián)膠原-硫酸軟骨素-透明質酸，結果表明未經過交聯(lián)的膠原支架的解鏈溫度是(46.5±1.09)℃，而經過交聯(lián)的膠原支架解鏈溫度提高到了(78.6±1.26)℃，并且還發(fā)現(xiàn)用京尼平進行交聯(lián)的支架有良好的生物相容性和再現(xiàn)性，未發(fā)現(xiàn)細胞不良反應。用京尼平交聯(lián)所構建的膠原蛋白支架可以為軟骨細胞的生長提供了一個良好的環(huán)境。

1.4 碳化二亞胺 目前1-乙基-3(3-二甲丙氨基)碳化二亞胺較為常用，碳化二亞胺的交聯(lián)產物具有很低的免疫原性，且未發(fā)現(xiàn)有細胞毒性，因此，它的生物兼容性很好，并且可以產生較好的交聯(lián)效果。許多實驗常將碳化二亞胺與NHS聯(lián)合使用，并且取得了較好的交聯(lián)效果。Ma等[10]關于加強膠原蛋白多孔支架穩(wěn)定性的研究中，應用EDAC/NHS進行交聯(lián)，結果顯示用EDAC/NHS可以形成多孔支架，并且具有較好的細胞相容性，其作用機制是在膠原蛋白相鄰的分子之間形成異構肽鍵。單獨使用EDC，在濃度為20 mM進行交聯(lián)時，交聯(lián)效果與強度要好于GTA，EDC在水性環(huán)境中反應的中間體快速發(fā)生水解，NHS對中間物有穩(wěn)固作用，并且允許胺類反映，并且再用乙醇作為溶劑的條件下，可減少或限制有活性的EDC誘導劑的水解，從而提高交聯(lián)效果[11]。有許多實驗將2種交聯(lián)劑聯(lián)合使用來交聯(lián)膠原，實驗表明交聯(lián)后的膠原解鏈溫度明顯提高，胺類含量降低[12]。Pieper等[13]用 EDC/NHS交聯(lián)Ⅱ型膠原基質，實驗結果表明經過EDC/NHS交聯(lián)后，解鏈溫度較交聯(lián)前提高8℃，抵抗膠原酶水解能力明顯增強。Angele等發(fā)現(xiàn)EDC/NHS交聯(lián)后的膠原抗膠原酶水解的能力明顯提高，較低的濃度(0.5 mg/m L)就可以引起很大的變化，但是高濃度(30 mg/m L EDC/NHS)反而使支架的抗折強度下降。

1.5 環(huán)氧化合物(epoxy compound，EC) 是指分子中含有一個或多個環(huán)氧基的一類化合物，包括環(huán)氧乙烷、環(huán)氧氯丙烷等，目前EC對膠原物質交聯(lián)作用的研究也較多，并且發(fā)現(xiàn)交聯(lián)效果較好，與GTA的交聯(lián)效果進行相比，用EC交聯(lián)后解鏈溫度都有所提高，但EC的交聯(lián)速度明顯慢于GTA。經EC改性的膠原具有較好的生物學和物理學性能，盡管EC完全反應時間較長，交聯(lián)膠原的變性溫度比GTA交聯(lián)者低。Wang等[14]在應用GTA和EC交聯(lián)膠原傳輸特性的研究中發(fā)現(xiàn)，應用這2種交聯(lián)劑交聯(lián)的膠原膜都會導致茶堿和苯佐卡因擴散系數(shù)的降低，其膨脹速度比未交聯(lián)的膠原膜減少50%。研究還發(fā)現(xiàn)應用EC交聯(lián)后的膠原蛋白鈣含量測試結果明顯低于GTA交聯(lián)的結果，但經過優(yōu)化EC結構(環(huán)氧基數(shù)量、鏈結構等)和反應條件(溫度、p H、促進劑等)，可獲得更好的交聯(lián)效果[15]，因此，經過優(yōu)化的EC有望成為一種較為理想的化學交聯(lián)劑。

1.6 ?；B氮 二苯基磷酸鹽(DPPA)?；B氮化合物可用于交聯(lián)膠原。與GTA交聯(lián)的膠原相比，酰基疊氮的交聯(lián)物不易鈣化，未發(fā)現(xiàn)有細胞不良反應，交聯(lián)后的膠原支架解鏈溫度和強度也都明顯提高。但是，用酰基疊氮進行交聯(lián)常常需要進行幾天以上的反應和洗滌過程，工藝十分復雜。Marinucci等[16]采用DPPA進行交聯(lián)膠原膜，并且與未交聯(lián)的膜和用GTA交聯(lián)的膜進行對比，結果發(fā)現(xiàn)應用DPPA交聯(lián)的膠原期細胞的擴增速度明顯高于未交聯(lián)和使用GTA進行交聯(lián)的膠原膜，成纖維細胞在DPPA交聯(lián)的膠原膜上產生的TGF1明顯高于用GTA交聯(lián)的膠原膜。目前許多研究均表明應用DPPA交聯(lián)膠原支架有良好的細胞相容性，細胞的擴增速度明顯高于未交聯(lián)的膠原支架，但上述實驗結果必須留心觀察，因為在體內反應是比較復雜的過程，也許效果沒有在體外的好。

1.7 醌類 1，4-二(3，4-羥基苯)-2，3-二甲基丁烷(NDGA)，作為一種可以改性膠原蛋白的交聯(lián)劑，也具有良好的交聯(lián)效果，用NDGA交聯(lián)的膠原比用GTA交聯(lián)的膠原的張力和彈性系數(shù)都有明顯的提高，其作用機制是通過將鄰苯二酚官能團氧化成醌來進行交聯(lián)反應，NDGA交聯(lián)的產物可為成纖維母細胞提供較有利的附著和增殖環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，NDGA交聯(lián)的膠原支架在體內有很好的穩(wěn)定性，并且在NDGA交聯(lián)的多孔支架中應用葡萄糖傳感器，發(fā)現(xiàn)并未對葡萄糖傳感器造成影響。Young等[17]在用膠原蛋白構建支架，并植入傳感器來增強生物相容性的研究中，應用NDGA進行交聯(lián)來提高膠原支架的穩(wěn)定性，研究發(fā)現(xiàn)NDGA交聯(lián)可以獲得較好的穩(wěn)固性，當植入大鼠皮下4周后觀察，沒有發(fā)現(xiàn)形態(tài)變化，支架浸泡在膠原酶溶液中4周后，溶解后的重量約保留最初的70%，而且還發(fā)現(xiàn)用NDGA交聯(lián)對植入內部的傳感器沒有損害。Koob等[18-19]應用NDGA交聯(lián)膠原的研究中，在對材料進行的拉伸試驗和彈性系數(shù)測試中，發(fā)現(xiàn)抗拉力強度明顯高于天然的跟腱，并且彈性系數(shù)與天然的跟腱相當。

2 結 語

膠原蛋白的理想交聯(lián)方法應該是在保證所交聯(lián)的膠原蛋白不變性的同時，還要具備無毒副作用，化學交聯(lián)方法的交聯(lián)度明顯高于物理交聯(lián)，但由于存在引入外源有毒試劑，化學反應殘留物清除難、變色等問題，使其在組織工程應用研究中均存在局限性。如采用GTA、EC、紫外線等方法進行交聯(lián)時，膠原蛋白會變黃;NDGA處理過的膠原纖維會變棕色;應用京尼平交聯(lián)的膠原蛋白會變藍色等，變色的原因是使用的化學交聯(lián)劑和氨基酸反應所致，并且用化學交聯(lián)劑交聯(lián)后的膠原蛋白纖維上會出現(xiàn)脊和沿縱軸的裂隙，造成這一現(xiàn)象的原因是纖維的下層結構和(或)由于交聯(lián)劑反應所形成，但是這種結構顯現(xiàn)出有利于細胞的黏附和成纖維細胞的遷移，膠原纖維表面粗糙的程度取決于化學交聯(lián)劑的選用，不同交聯(lián)劑會形成不同的膠原纖維表面特征。在性能方面，經過交聯(lián)的膠原纖維解鏈溫度會明顯提高，如應用GTA和EC交聯(lián)的膠原蛋白纖維顯示出了最高的熱穩(wěn)定性，原因是它可以交聯(lián)蛋白中大量的亞單位包括距離較遠的亞單位，但GTA具有明顯的細胞毒性，EC交聯(lián)時間太長;碳化二亞胺、NDGA、DPPA、京尼平等有較好的交聯(lián)效果，并且細胞不良反應很小，是近些年應用相對較多的化學交聯(lián)劑，但目前很多實驗都是在體外進行的，其化學交聯(lián)劑反應的環(huán)境遠遠沒有體內的反應環(huán)境復雜，所以在應用到體內時，其交聯(lián)效果和不良反應等問題是值得關注和研究的。

因此，在應用化學試劑對膠原蛋白進行交聯(lián)的應用中，必須根據(jù)實驗目的來選擇不同的化學交聯(lián)劑，以保證交聯(lián)后可以提高性能的同時還要達到保持膠原蛋白的生物活性，并且對種子細胞沒有毒副作用。有時某單一化學交聯(lián)劑對膠原改性并不能滿足材料的要求，因此，在膠原蛋白的交聯(lián)中可采用2種或2種以上交聯(lián)方法結合的辦法。另外，相關研究發(fā)現(xiàn)乙醛酸中的羰基活性較強，易于與膠原側鏈的氨基反應，從而可提高收縮溫度，還有通過交聯(lián)蛋白質分子中起重要作用的二硫鍵來改性膠原蛋白，以提高其特性。雖然這2種目前在組織工程方面應用較少，但為今后的研究提供了很有價值的思路。隨著科學的發(fā)展，上述化學交聯(lián)劑在應用中各問題的克服和解決，定能找到更好、更適合的膠原蛋白交聯(lián)劑應用于組織工程的研究，制作出與人體組織結構和性能相似的、安全的生物支架材料。

[1]Sally R，F(xiàn)renkel PE ，Di Cesare，et al.Scaffolds for articular cartilage repair annals of biomedical egineering[J].Annals of Biomedical Engineering ，2004，32:26.

[2]Chajra H，Rousseau CF，Cortial D，et al.Collagen-based biomaterials and cartilage engineering.Application to osteochondral defects[J].Bio-Medical Materials and Engineering，2008 ，18:33.

[3]Naimark WA ，Pereira CA ，Tsang K ，etal.Cross-linking of bovine pericardialtissue:a potentialrole of the solvent environment in the design of bioprost hetic materials[J].Journalof Materials Science:Materials in Medicine，1995，6:235.

[4]Chang Y ，Lee M H ，Liang HC ，etal.Acellular bovine pericardia with distinct porous structures fixed with genipin as an extracellular matrix[J].Tissue Engineering，2004，10:881.

[5]Sung HW，Chang WH，Ma CY，et al.Crosslinking of biologicaltissues using genipin and/or carbodiimide[J].Journal of Biomedical Materials Research Part A ，2003，64:427.

[6]Sung HW，Liang IL ，Chen CN，etal.S tability of a biological tissue fixed with a naturally occurring crosslinking a-gent(genipin)[J].Journal of Biomedical M aterials Research Part A，2001 ，55:538.

[7]Chih-Shen Ko，Chun-Hsien Wu，Hsin-Ho Huang，et al.Genipin cross-linking of type II collagen-chondroitin sulfate-hyaluronan scaffold for srticular cartilage therapy[J].Journalof Medicaland Biological Engineering ，2007，27:436.

[8]Sundararaghavan HG，Monteiro GA，Lapin NA ，et al.Genipin-induced changes in collagen gels:correlation of mechanical properties to fluorescence[J].Journalof Biomedical M aterials Research Part A，2008，87(2):308.

[9]Ko CS，Huang JP，Huang CW ，et al.Type II collagenchondroitin sulfate-hyaluronan scaffold cross-linked by genipin for cartilage tissue engineering[J].Journalof Bioscience and Bioengineering，2009 ，107:177.

[10]Ma L ，Gao CY ，Mao ZW ，etal.Enhanced biologicalstability of collagen porous scaffolds by using amino acids as novel cross-linking bridges[J].Biomaterials，2004，25:2997.

[11]Catherine P ，Barnes，Charles W ，et al.C ross-linking electrospun type II collagen tissue engineering scaffolds with carbodiimide in Ethanol[J].Tissue Engineering，2007，13:1593.

[12]Pieter B，Jeroen S，Pieper T ，et al.Cross-linked type I and type II collagenous matrices for the repair of full-thickness articular cartilage defects-A study in rabbits[J].Biomaterials，2003，24:3255.

[13]Pieper JS，van der Kraan PM ，Hafmans T ，et al.Crosslinked type II collagen matrices:preparation，characterization，and potentialforcartilage engineering[J].Biomaterials Vol，2002 ，23:3183.

[14]Wang SY，Hsieh CY，Wang DM，et al.Mass transfer characteristics of glutaraldehyde-crosslinked and epoxy-crosslinked collagen films[J].Journalof Medicaland Biological Engineering，2003 ，23:165.

[15]但年華，但衛(wèi)華，曾睿，等.環(huán)氧化合物及其在膠原改性中的應用[J].材料導報，2006，20:119.

[16]M arinucci L，Lilli C，Guerra M ，et al.Biocompatibility of collagen membranes crosslinked with glutaraldehyde or diphenylphosphorylazide:an in vitro study[J].Journal of Biomedical Materials Research Part A，2003 ，67:504.

[17]Young MJ，Yu BZ，Koob TJ，et al.A novel porous collagen scaffold around an implantable biosensor for improving biocompatibility.I.In vitro/in vivo stability of the scaffold and in vitro sensitivity of the glucose sensor with scaffold[J].Journal of Biomedical M aterials Research Part A ，2007，87:136.

[18]Koob TJ，Hernandez DJ.Material properties of NDGA polymerized collagen fibers:development of biologically-based tendon constructs[J].Biomaterials，2002，23:3.

[19]Koob TJ，Daniel J，Hernande Z.Mechanical and thermal properties of novel polymerized NDGA-gelatin hydrogels[J].Biomaterials，2003，24:1285.