鴨MCHR2的基因克隆及蛋白表達鑒定

朱 勇，汪長東，劉革力，袁成福，卜友泉，易發(fā)平，焦慶昉，艾 青，劉 竹，蘭 歡，武向梅，宋方洲，胡平生，Tomas Hokfelt

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016; 2.Karolinska Institutet，Stockholm，Sweden SE-11276/S-17177)

隨著人們生活水平的不斷提高，飲食條件的巨大改善，肥胖癥的發(fā)病率在全世界呈逐年快速上升的趨勢，特別是在高速發(fā)展的中國。肥胖癥作為一種營養(yǎng)代謝性疾病，是心腦血管疾病、糖尿病、高血壓、高脂血癥以及癌癥等多種疾病的高危因素，現(xiàn)已成為一個全球性的健康問題。多年來的研究發(fā)現(xiàn)［1－2］下丘腦作為攝食中樞所分泌的多種神經(jīng)肽物質(zhì)與肥胖的發(fā)生有著密切的關(guān)系。其中，黑色素濃集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)作為一種能增強食欲的神經(jīng)肽，從發(fā)現(xiàn)之日起，就受到了大家的廣泛關(guān)注。隨著研究的逐步深入，相繼發(fā)現(xiàn)了MCH的兩個受體亞型——MCHR1和MCHR2，從而為肥胖發(fā)生機制的研究以及防治提供了新的靶點。目前，通過成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因和基因敲除動物模型，對MCH及MCHR1受體與肥胖之間的關(guān)系進行了較為深入的研究，而對于MCHR2的研究則較為緩慢，功能也尚不明確。其主要的研究瓶頸在于無法找到合適的動物模型用于MCHR2功能的研究。國內(nèi)外大量報道均證明，MCHR2在大鼠、小鼠等嚙齒類動物中無表達。為此，本研究擴大了MCHR2表達動物的篩選范圍，通過 RT-PCR及Western blot證明了鴨腦組織中，MCHR2在mRNA水平和蛋白水平都是具有較高表達，為進一步構(gòu)建MCHR2研究的動物模型提供了實驗依據(jù)。這一結(jié)果在國內(nèi)外尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與試劑 正常鴨、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、犬、羊、豬由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供;總RNA提取試劑盒為天根公司產(chǎn)品;RT-PCR試劑盒、PCR擴增試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品;兔抗人MCHR2抗體為A bcam公司產(chǎn)品;HRP標記的兔抗羊IgG為北京鼎國公司產(chǎn)品;真核表達人MCHR2的重組質(zhì)粒DNA為本實驗室前期已構(gòu)建。所需引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.2 引物設(shè)計與合成 登錄 GenBank查詢?nèi)恕⒑铩⑷作鳰CHR2基因的序列(序列號分別為:AY562946、AF513989、AY112659、AY112899)，經(jīng) Primer premier 5.0軟件進行序列對比后設(shè)計合成引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。擴增MCHR2基因的全長cDNA片段(1023 bp)的上游引物:5'-ATGAATCCATTTCATGCATCTTG-3';下游引物:5'-CCCATATTGTTGATTTCCTTCTC-3'。

1.2 方法

1.2.1 動物腦組織總RNA的提取及RT-PCR反應(yīng) 正常鴨、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、狗、羊、豬腦組織經(jīng)取出后立即置于預(yù)冷的研缽，將組織經(jīng)液氮充分研磨成粉，按天根公司總RNA提取試劑盒說明書獲得總RNA提取液，并通過瓊脂糖凝膠電泳和測定吸光度值判斷總RNA的質(zhì)和量。按天根公司 RT-PCR試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5 min;95℃ 30 s;55℃ 30 s; 72℃ 1 min;35個循環(huán);72℃ 10 min;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 動物腦組織和HeLa細胞蛋白的提取及 Western blot鑒定 取正常鴨、狗、羊、豬腦組織和處于對數(shù)生長期HeLa細胞，按蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取40 μg處理的蛋白樣品進行 SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫振蕩封閉1 h，與1∶1 000稀釋的羊抗 MCHR2一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜 3次，每次10 min，與 HRP標記的的兔抗羊 IgG二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次 10 min，發(fā)光，暗室顯影。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增MCHR2全長CDNA 見Fig 1。

Fig 1 Analysis of MCHR2 expression in brain tissue of animals by RT-PCR

2.2 MCHR2蛋白在動物腦組織中的表達 Western印跡檢測結(jié)果如Fig 2所示:在鴨腦組織中檢測到 MCHR2在蛋白水平具有較高表達，在犬海馬及皮質(zhì)區(qū)MCHR2也有一定表達，而在豬海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)MCHR2分別是低表達的和無表達的。

Fig 2 Identification and analysis of MCHR2 protein by Western blot

2.3 MCHR2蛋白在鴨腦組織和 HeLa細胞中的表達Western印跡檢測MCHR2蛋白在鴨腦組織中的表達情況并以HeLa細胞蛋白為對照。結(jié)果如Fig 3所示:MCHR2蛋白在鴨腦組織中的確具有高表達，重復(fù)了Fig 2中的結(jié)果;而對照組HeLa細胞中則無MCHR2蛋白的表達。

Fig 3 Identification and analysis of MCHR2 protein in duck brain tissue by Western blot

3 討論

MCH是一類由下丘腦分泌的能促進食欲的神經(jīng)肽物質(zhì)，其在體重調(diào)節(jié)和能量代謝方面起著重要作用。Ludwig等［3］通過直接在腦室內(nèi)注射 MCH刺激大鼠及小鼠食物攝入增加，引起體重增長，最終導(dǎo)致肥胖。該研究小組隨后建立了過度表達MCH的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠攝食增加，并產(chǎn)生了高脂蛋白血癥、高血糖及胰島素抵抗。而Shimada等［4］則通過建立MCH敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠進食減少、消瘦，并出現(xiàn)了代謝率增加。MCH生物學(xué)功能和兩個 G蛋白偶聯(lián)受MCHR1和MCHR2密切相關(guān)［5－7］。MCHR1與 MCHR2分別由353和340個氨基酸殘基組成，都是有7個跨膜α螺旋的G蛋白偶聯(lián)受體超家族(GPCRs)I類成員，兩個受體具有38%的同源性［8］。MCHR1在嚙齒類及多種高等動物體內(nèi)均有表達，其主要分布于大腦皮質(zhì)層、丘腦、下丘腦、海馬、杏仁核及蒼白球。MCHR2則主要分布于大腦皮質(zhì)、海馬、下丘腦腹側(cè)、杏仁核及屏狀核等區(qū)域，并且目前發(fā)現(xiàn)MCHR2僅在人、恒河猴、犬、白鼬中有表達，而在嚙齒類動物中無表達［9］。兩種受體的分布區(qū)域與攝食行為、能量代謝、情緒調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Chen等［10］通過建立 MCHR1基因敲出小鼠(MCHR1-/-mice)發(fā)現(xiàn)小鼠消瘦，但是進食增多，推測其消瘦是由于運動量增大導(dǎo)致能量代謝率增高而引起的。而MCH-/-小鼠出現(xiàn)消瘦是則由于進食減少和代謝增高而引起。從這兩者引起小鼠消瘦原因的差異，推斷可能是MCHR2在進食及能量代謝方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，所以弄清MCHR2在體重調(diào)節(jié)和能力代謝等方面的作用以及分子機制顯得尤為重要。目前對MCHR1的研究比較透徹，而對于MCHR2的研究，由于受到動物模型構(gòu)建的局限性，進展得非常緩慢。因此，能否突破構(gòu)建動物模型的瓶頸，成為進行MCHR2體內(nèi)水平研究的重要因素。

本實驗室基于前期對MCHR2相關(guān)表達及功能分析的基礎(chǔ)上［11］，擬構(gòu)建穩(wěn)定表達MCHR2基因的動物模型，觀察其進食行為、體重及新陳代謝的變化，以探明該受體可能的生理功能，為肥胖癥的防治研究提供新的靶點。但據(jù)文獻報道目前 MCHR2只在人、恒河猴、犬、白鼬有表達，而在嚙齒類動物如:在大鼠、小鼠和倉鼠等中無表達。為了找到能夠穩(wěn)定表達MCHR2的動物以構(gòu)建動物模型，我們從大鼠、小鼠、犬、羊、豬、鴨等腦組織中提取總 RNA和蛋白質(zhì)，用 RTPCR和Western blot的方法檢測MCHR2在上訴幾種動物中的表達情況。人 MCHR2 cDNA全長為1 023 bp，編碼具有340個氨基酸的蛋白質(zhì)，我們先以人的MCHR2基因的全長cDNA編碼序列進行比對后設(shè)計引物，采用RT-PCR方法擴增上訴動物腦組織中的MCHR2全長cDNA片段。RT-PCR的結(jié)果顯示SD鼠、Wista鼠、C3H10小鼠、C57小鼠未出現(xiàn)目的條帶，而在鴨、犬、豬3組中出現(xiàn)了長約1 023 bp的目的片段;同時還證明了MCHR2基因在羊中并無表達。RT-PCR的結(jié)果一方面印證了文獻報道中MCHR2在大鼠、小鼠等嚙齒類動物中無表達的結(jié)論;另一方面也證實了MCHR2在犬中是有一定表達的;除此之外，我們發(fā)現(xiàn)MCHR2在豬腦組織中有一定表達，但相對較弱;而在鴨腦組織中則具有較高表達。隨后，我們分別提取犬和豬腦組織皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)蛋白以及鴨腦組織蛋白檢測MCHR2在蛋白水平的表達情況。結(jié)果顯示，MCHR2蛋白在鴨腦組織中具有很高的表達，在犬海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)均具有一定的表達(海馬區(qū)表達高于皮質(zhì)區(qū))，而在豬海馬中表達較低，在豬腦皮質(zhì)區(qū)則完全沒有表達。單獨檢測MCHR2在鴨腦組織中的表達，得到了同樣的結(jié)果。自此，我們通過 RT-PCR和Western blot分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平分析鑒定了MCHR2在犬和鴨體內(nèi)具有穩(wěn)定的表達，而在豬體內(nèi)由于表達量較低，其是否能夠穩(wěn)定表達還需實驗進一步證實。MCHR2在犬腦組織中表達早已有文獻報道，而在鴨腦組織中的高表達則是由本實驗組首次報道。由于MCHR2在大鼠、小鼠等嚙齒類動物中無表達，而相比犬、猴等大型動物，鴨體積較小，容易進行實驗處理和觀察，這使得將鴨作為MCHR2基因表達及相關(guān)功能研究的動物模型具有了可能性，但是否具有切實可行性，還需進行相關(guān)的預(yù)實驗進一步論證。

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