氯化鋰對脾切除大鼠海馬tau蛋白的影響

譚文斐，田阿勇，王俊科，曹學照，馬 虹

(中國醫科大學第一醫院麻醉科，遼寧 沈陽 110001)

氯化鋰能夠抑制糖原合成酶-3β(GSK-3β)，對蛋白激酶的活性進行調節［1］，進而影響 tau蛋白磷酸化。近些年，術后認知功能障礙逐漸成為研究熱點，但是，對于手術創傷誘發中樞神經系統炎性反應如何影響與記憶有關的tau蛋白的研究并不多見。研究提示，手術創傷引發了大鼠短暫的記憶下降，并且伴隨有海馬內炎性因子的釋放［2］。因此，探討手術創傷誘發海馬炎性因子是否通過GSK-3β通路介導tau病理變化是很有意義的。

1 材料與方法

1.1 動物和手術 150只♂ 6月齡SD大鼠吸入異氟烷麻醉誘導后氣管插管，機械通氣維持異氟烷濃度為1.5%，麻醉期間保持大鼠直腸溫度在(36～37)℃。大鼠隨機分為4組:健康對照組(group A，n=15);麻醉組(group B，n=45);手術和氯化鈉組(group C，n=45)，異氟烷麻醉后脾切除，腹腔注射氯化鈉;手術和氯化鋰組(group D，n=45)，異氟烷麻醉后脾切除，腹腔注射氯化鋰 200 mg·kg－1［3］，從實驗開始持續至術后7 d，每天1次。氯化鈉組給予同等容積的氯化鈉。B、C、D組所有動物均麻醉2 h，B組麻醉2 h后即刻處死，C，D 組手術后 1、3、7 d處死(15只/時點)。每個時點標記為 B1、B3、B7、C1、C3、C7、D1、D3 和 D7。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR 按照參考文獻［4］，利用 Applied Biosystems(ABI公司，美國)系統進行實時定量 PCR。大鼠 IL-1β上游引物:5'-ATCCCAAACAATACCCA-3'，下游引物:5'-CAACTATGTCCCGACCA-3';TNF-α上游引物:5'-CCACGC TCTTCTGTCTACTG-3'，下 游 引 物:5'-GCTACGGGCTTGTCACTC-3';3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)上游引物:5'-GCAAGTTCAACGGCACA-3'，下 游 引 物:5'-CATTTGATGTTAGCGGGAT-3'。PRISM 7500HT檢測系統(ABI公司，美國)進行熒光測定，以 GAPDH為對照，IL-1β mRNA和 TNF-α mRNA 為 測 試，對 循 環 數 Ct值 計 算 后 (比 值(測試/對照)=2Ct對照－Ct測試)進行比較。

1.2.2 Western blot 按照參考文獻［5］，海馬組織用溶解液勻漿處理后提取蛋白。蛋白提取物置入加樣緩沖液，100℃煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉膜。分別與一抗(1∶500，Signalway Antibody，美國)4℃過夜。其后，膜與辣根過氧化物酶結合二抗室溫孵育2 h。最后膜與ECL系統曝光，成像。以β-actin的光密度值做為內參照，采用目標條帶與β-actin的光密度值比值做為指標進行統計學分析。

2 結果

2.1 手術創傷誘發炎性反應 與A組比較，B組各時點IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β 和 TNF-α 的表達水平差異無統計學意義(P＞0.05)，C組、D 組術后 IL-1β mRNA、TNF-α mRNA和IL-1β的表達上調(P＜0.01)，見 Tab 1。

Tab 1 Expression of IL-1β and TNF-α mRNA and protein(±s，n=5)

Tab 1 Expression of IL-1β and TNF-α mRNA and protein(±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs group A

Group IL-1β mRNA TNF-α mRNA IL-1β TNF-α A 1.04 ±0.05 1.20 ±0.07 0.60 ±0.01 0.39 ±0.01 B1 1.26 ±0.05 1.34 ±0.05 0.62 ±0.01 0.38 ±0.01 B3 1.44 ±0.05 1.26 ±0.05 0.60 ±0.02 0.40 ±0.01 B7 1.40 ±0.10 1.24 ±0.05 0.61 ±0.01 0.41 ±0.02 C1 2.52 ±0.08＊＊ 1.47 ±0.04＊＊ 1.15 ±0.05＊＊ 0.40 ±0.01 C3 1.54 ±0.09＊＊ 1.22 ±0.08 0.59 ±0.02 0.39 ±0.03 C7 1.14 ±0.05 1.22 ±0.04 0.58 ±0.01 0.40 ±0.01 D1 2.46 ±0.09＊＊ 1.48 ±0.01＊＊ 0.98 ±0.03＊＊ 0.40 ±0.03 D3 1.54 ±0.05＊＊ 1.24 ±0.05 0.59 ±0.02 0.39 ±0.02 D7 1.16 ±0.09 1.22 ±0.04 0.59 ±0.03 0.40 ±0.02

Tab 2Expression of site-specific phosphorylation of tau and GSK-3β(±s，n=5)

Tab 2Expression of site-specific phosphorylation of tau and GSK-3β(±s，n=5)

＊＊P＜0.01 vs group A

Group Total tau pT205 pS396 GSK-3β pGSK-3β A 76 ±0.02 B1 1.14 ±0.04 1.22 ±0.03 0.96 ±0.02 0.91 ±0.04 0.76 ±0.03 B3 1.12 ±0.04 1.23 ±0.05 0.97 ±0.05 0.91 ±0.04 0.79 ±0.07 B7 1.14 ±0.05 1.21 ±0.04 0.96 ±0.01 0.91 ±0.05 0.77 ±0.07 C1 1.14 ±0.05 1.23 ±0.08 0.97 ±0.06 0.92 ±0.02 0.76 ±0.04 C3 1.15 ±0.02 4.53 ±0.05＊＊ 2.15 ±0.03＊＊ 0.90 ±0.06 0.34 ±0.08＊＊C7 1.14 ±0.02 1.22 ±0.06 0.96 ±0.06 0.89 ±0.04 0.76 ±0.06 D1 1.14 ±0.04 1.22 ±0.01 0.97 ±0.01 0.91 ±0.04 0.75 ±0.08 D3 1.14 ±0.04 1.23 ±0.02 0.95 ±0.05 0.89 ±0.06 0.76 ±0.07 D7 1.14 ±0.02 1.22 ±0.05 0.95 ±0.05 0.91 ±0.02 0 1.16 ±0.04 1.22 ±0.01 0.97 ±0.03 0.91 ±0.02 0..76 ±0.07

2.2 炎癥反應通過激活GSK-3β誘發tau蛋白磷酸化 與A 組比較，B 組各時點 tau、pT205、pS396、GSK-3β 和 p-GSK-3β的表達水平差異無統計學意義(P＞0.05)，C組術后pT205和 pS396的表達上調，而 p-GSK-3β表達下調(P＜0.01)。D組給予氯化鋰后 pT205、pS396和 p-GSK-3β的表達恢復對照水平，說明GSK-3β活性抑制后 tau蛋白磷酸化水平恢復，見Tab 2。這些結果提示，炎性因子對 tau蛋白磷酸化的影響是通過GSK-3β介導的。

3 討論

Tau蛋白在非神經源性細胞中的過度表達可誘導細胞凋亡［6］，而磷酸化 tau蛋白可以誘發神經細胞病理變化［7］，損害記憶形成。脾切除術可反映切除一個器官的手術創傷，同時脾又是一個免疫器官，實施脾切除術大鼠海馬內激活炎性因子的釋放［2］。有研究表明GSK-3β可以被炎性因子 IL-1β和TNF-α激活，導致蘇氨酸205位點 tau蛋白磷酸化增加［8］。還有研究發現氯化鋰可通過誘導失活形式的 p-GSK-3β表達增高而抑制GSK-3β的活性，進而抑制Tau蛋白磷酸化［5］。這些結果都支持本研究結論。

本研究發現接受脾切除的大鼠，海馬內炎性因子可以激活GSK-3β，誘發 tau蛋白高度磷酸化。利用氯化鋰抑制GSK-3β的活性，可以使高度磷酸化的tau蛋白恢復正常對照組水平。氯化鋰可能成為治療術后認知功能障礙的臨床策略中一個選擇。

［1］ Li X，Bijur G N，Jope R S.Glycogen synthase kinase-3beta，mood stabilizers，and neuroprotection［J］.Bipolar Disord，2002，4(2):137－44.

［2］ Wan Y，Xu J，Ma D，et al.Postoperative impairment of cognitive function in rats:a possible role for cytokine-mediated inflammation in the hippocampus［J］.Anesthesiology，2007，106(3):436 － 43.

［3］ Tsaltas E，Kontis D，Boulougouris V，Papadimitriou G N.Lithium and cognitive enhancement:leave it or take it［J］.Psychopharmacology(Berl)，2009，202(1 －3):457 －76.

［4］ Rosczyk H A，Sparkman N L，Johnson R W.Neuroinflammation and cognitive function in aged mice following minor surgery［J］.Exp Gerontol，2008，43(9):840 － 6.

［5］ 孫治坤，楊紅旗，陸國強，等.氯化鋰抑制β-淀粉樣蛋白誘導細胞 Tau蛋白磷酸化［J］.中國藥理學通報，2008，24(1):24－8.

［5］ Sun Z K，Yang H Q，Lu G Q，et al.The effects of LiCl on Tau phosphoryla tion induced by β-amyloid peptide［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):24 －8.

［6］ 李 琪，馮利杰，王海萍，等.tau蛋白的過度表達對非神經源細胞生長與分化的影響［J］.中國藥理學通報，2008，24(3):365－9.

［6］ Li Q，Feng L J，Wang H P，et al.Effects of tau overexpression on non-neuronal cell growth and differentia tion［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(3):365 － 9.

［7］ 褚燕琦，張 蘭，李 瑋，等.人參皂苷對蛋白磷酸酶抑制劑岡田酸擬阿爾采末病細胞模型的影響［J］.中國藥理學通報，2008，24(7):879 －84.

［7］ Chu Y Q，Zhang L，Li W，et al.Effects of ginsenoside on cellular model of Alzheimer disease induced by protein phosphatase inhibitor okadaic acid［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(7):879 －84.

［8］ Kitazawa M，Trinh D N，LaFerla F M.Inflammation induces tau pathology in inclusion body myositis model via glycogen synthase kinase-3beta［J］.Ann Neurol，2008，64(1):15 － 24.