肺癌侵襲轉移相關microRNAs的研究進展

尤嘉琮 綜述 周清華 審校

肺癌侵襲轉移是肺癌的惡性標志和特征，也是肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。肺癌侵襲轉移是一個多因素調控、多步驟、多階段、連續復雜的生物學過程，是癌細胞從原發部位轉移到遠端部位形成腫瘤的過程[1,2]，主要包括腫瘤細胞脫離原發灶、進入循環系統（血液循環與淋巴循環）、侵襲靶器官、遠處克隆和血管生成形成轉移灶。肺癌侵襲轉移涉及多因素、多水平的調節。MicroRNA（miRNA）是一類高度保守、長度很短的非編碼調控單鏈RNA，約20 nt-24 nt，通過與目標mRNA互補配對導致mRNA降解或抑制轉錄后翻譯誘導基因沉默。miRNA參與生命過程中一系列的重要進程，包括發育、造血、器官形成、凋亡和細胞增殖、癌癥的發生和發展等。近年來大量研究[3,4]表明，miRNAs與人類多種腫瘤的發生、發展及侵襲轉移存在著密切關系。迄今，有關miRNA與肺癌侵襲轉移相關的研究已有較多報道，但其確切機制尚未明確，隨著人們對miRNAs研究不斷深入，已證明 miRNAs在肺癌侵襲轉移調控中發揮著重要作用。

1 miRNAs調節腫瘤細胞轉移的分子機制

1.1 調節癌基因或抑癌基因表達 miRNAs可通過下調抑癌基因表達，促進腫瘤細胞侵襲轉移。Asangani等[5]發現在結腸癌細胞cob206f中ΡDCD4為miR-21的靶基因，二者呈負相關，指出miR-21是通過抑制PDCD4的表達而影響腫瘤細胞浸潤轉移的。ΡDCD4已被證實為腫瘤抑制基因，PDCD4能與轉錄起始因子eIF4A和eIF4G相互作用而抑制基因轉錄。在66%的肺癌患者中，miR-21至少有2倍的上調[6]。抑癌基因ΡTEN和sprouty2（SΡRY2）也是miR-21的靶基因。Meng等[7]分析了正常肝細胞和肝癌細胞中197種miRNAs的表達，發現肝癌細胞中miR-21的含量顯著高于正常肝細胞，揭示了miR-21下調PTEN的表達，進而通過影響PI3K信號途徑而促進腫瘤細胞的增殖和轉移。Sayed等[8]在結腸癌細胞SW480中下調miR-21表達后，發現腫瘤細胞的遷移能力顯著下降，并證實了這一過程是通過上調其靶基因SΡRY2的表達，使細胞微絨毛活動受限而實現的。miRNAs可通過下調癌基因表達而抑制腫瘤細胞的侵襲轉移。Li等[9]研究表明，在肝癌細胞中miRNA-34a可下調原癌基因c-MET的mRNA水平和蛋白水平的表達，從而降低c-MET誘導的細胞外信號調節激酶ERK1/2的活性，抑制腫瘤細胞侵襲轉移。

1.2 調節轉移相關基因表達 miRNAs通過調節SOX4、RDX、RhoA等腫瘤轉移相關基因表達，調控腫瘤細胞的侵襲轉移。在乳腺癌細胞中miR-335通過靶向抑制轉錄因子SOX4和細胞外基質成分鈣粘蛋白C的表達，調控腫瘤細胞的增殖，抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移[10]。Cash以及Valastyan等[11,12]研究發現，miRNA-31可通過抑制Fzd3、ITGA5、MMΡ16、RDX和RhoA等促進轉移基因的表達水平，抑制乳腺癌細胞的侵襲轉移。Huang等[13]將高表達miRNA-373或miRNA-520c的非轉移乳腺癌細胞接種小鼠后，在小鼠的骨骼、腦和肺均產生了轉移灶，而對照組未發現轉移。研究證實，miRNA-373和miRNA-520c主要通過抑制其靶分子透明質烷表面受體CD44蛋白的表達而促進腫瘤細胞侵襲和轉移，CD44是一種腫瘤轉移抑制基因。在前列腺癌細胞中，也發現了miRNA-373和miRNA-520c可通過調節CD44而促進腫瘤細胞的轉移[14]。

1.3 調節腫瘤細胞上皮間質轉化 上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是上皮細胞在形態學上發生向成纖維細胞或間充質細胞表型轉變，并獲得遷移的能力。一些研究[15-19]證明EMT是腫瘤侵襲轉移的一個重要步驟，有許多miRNAs參與EMT調節。miRNA-200家族成員miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-429是EMT的重要調節因子[20]。miR-200家族可靶向作用于E-cadherin抑制因子ZEB1、ZEB2、SIP1和轉錄因子8，從而抑制上皮間質的轉化[21-23]。還有研究[24]發現ZEB1與miR-141及miR-200c之間存在著互反饋回路，即miRNA可下調ZEB1的表達，反過來ZEB1還可下調miR-141和miR-200c的表達，這一回路受到環境因子的影響，通過調控EMT過程參與腫瘤細胞的侵襲轉移。

1.4 調節腫瘤細胞血管生成 腫瘤血管生成是指腫瘤細胞通過分泌促血管生成因子激活靜息狀態的內皮細胞，使之增殖、遷移至腫瘤附近，并形成毛細血管網包繞腫瘤。腫瘤的生長有賴于新生血管提供血液灌注，為腫瘤組織提供氧氣和營養。新生的腫瘤血管管壁薄弱，基膜不完整，通透性高，是腫瘤組織發生轉移的結構基礎。Sufu和Fus-1在腫瘤轉移中具有抑制功能，microRNA-378可靶向抑制Sufu和Fus-1的表達，促進腫瘤細胞生長與腫瘤血管生成，加速腫瘤轉移[25]。miR-130a可下調GAX （growth arrestspecific homeobox）和HOXA5（homeobox protein hox A5）的表達，Chen以及Rhoads等[26,27]通過反義寡核苷酸技術降低miR-130a表達后，HOXA5蛋白過表達，進而下調VEGFR、HIF-1等促血管生成因子的表達，抑制腫瘤轉移。

1.5 調節腫瘤細胞DNA甲基化模式 miRNAs可通過抑制DNA甲基化相關酶，改變腫瘤細胞的DNA甲基化狀態，從而調控腫瘤的侵襲轉移。Fabbri等[28]通過實驗證明，在肺癌細胞A549和H1299中miR-29家族通過下調甲基轉移酶3A（DNMT3A）和甲基轉移酶3B（DNMT3B）的表達，減少腫瘤抑制基因FHIT和WWOX啟動子甲基化，抑制腫瘤形成。Duursma等[29]研究發現，在乳腺癌細胞MCF-7中miR-148可抑制DNMT3B表達。同時，一些腫瘤轉移相關miRNAs也受到甲基化調節。有研究發現miR-148a、miR-9家族的3個成員和miR-34b/c簇為超甲基化miRNA，它們呈現腫瘤特異性甲基化，這些miRNA的沉默可介導致癌基因和轉移相關基因的活化，如miR-34b/c可促使E3F3、C-MYC和CDK6激活，而miR-148a可促進TGIF2活化。在人原發性腫瘤中，miR-34b/c的甲基化與癌基因的上調明顯相關，可見在體內這些癌基因也是miRNA作用的靶標，而且miRNA的表觀遺傳學沉默可導致其在腫瘤患者體內高表達[30]。

1.6 調節腫瘤細胞粘附力 miRNAs通過調節腫瘤細胞粘附分子，改變細胞粘附力與侵襲力，實現調控腫瘤細胞的侵襲轉移。在黑色素瘤細胞中，let-7a可下調integrin β3的表達水平，同時抑制了腫瘤細胞的侵襲[31]。CD44也是介導細胞與細胞外基質之間粘附的重要分子，在乳腺癌和前列腺癌細胞中均發現 miRNA-373和miRNA-520c可抑制其靶基因CD44的表達，從而促進腫瘤細胞侵襲和轉移[13,14]。有研究發現，E-鈣粘蛋白為miR-9的靶基因，miR-9在肝癌細胞中高表達，可降低E-鈣粘蛋白的表達水平，抑制腫瘤細胞的轉移[32]。

2 肺癌侵襲轉移中miRNAs的調節功能

2.1 let-7 let-7是較早發現的與肺癌細胞侵襲轉移相關的miRNA家族，也是目前研究最為詳細的microRNA之一。目前已發現的pre-let-7家族成員多達125種，人類含有11種pre-let-7（hsa-let-7a-1, 2, 3、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsalet-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f-1, 2、hsa-let-7g、hsa-let-7i），共產生8種Mat-let-7，它們彼此基因序列高度保守，功能相似。let-7可以調控Hmga2基因的表達，HMGA2蛋白是一種高遷移率組A蛋白，在90%以上的肺癌中都有表達，而且與肺癌患者的存活率呈負相關，let-7通過HMGA2這一靶基因而調控肺癌細胞的遷移能力[33]。抑制let-7在正常NIH3T3細胞中的表達，可以誘導細胞惡性轉化[34]。let-7通過多種途徑抑制腫瘤細胞增殖。Johnson等[35]首先發現Ras家族蛋白也是let-7的靶蛋白，Ras的3'UTR含有多個與let-7互補的位點，let-7低表達可上調Ras蛋白表達水平，進而通過Ras蛋白這個膜相關GTPase信號蛋白調節細胞生長和分化。在K-ras突變的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）細胞A549和Calu-1中誘導表達let-7g，發現可幾乎完全抑制腫瘤在體內的形成，而未突變的NSCLC細胞H1650則只部分抑制了腫瘤的形成。重新過表達外源K-RasG12D又能拮抗let-7g引起的腫瘤抑制，而重新表達外源HMGA2則只能有限的影響let-7g抑制腫瘤的作用。let-7在腫瘤細胞中的過表達還可以改變細胞的細胞周期進行，降低腫瘤細胞分裂并誘導腫瘤凋亡[36,37]。

2.2 miR-200 在NSCLC細胞系A549中，Hurteau等[21]通過上調miR-200c的表達水平，發現帶鋅指結構的轉錄因子8（TCF8, ZEB1）的作用缺失，進而抑制了E鈣黏蛋白的表達，導致細胞形態改變，黏附力下降。E黏蛋白是EMT重要的誘導物，表明miR-200c通過調節EMT來抑制肺癌細胞的侵襲轉移。

2.3 miR-183 Wang等[38]研究發現，miR-183可以抑制肺癌細胞的遷移和侵襲能力。他們研究發現miR-183的表達水平與肺癌細胞的轉移能力呈負相關。在肺癌細胞中將miR-183過表達，能夠抑制肺癌細胞的遷移和侵襲。進一步研究其機制發現，VIL2編碼的蛋白Ezrin是miR-183的作用靶點，同時還發現miR-183可以調節其他與遷移和侵襲相關基因的表達水平，miR-183可能為一種腫瘤轉移抑制因子。

2.4 miR-125a-5p Wang等[39]近期研究發現，miR-125a-5p可以抑制肺癌細胞的侵襲轉移能力。EGFR（epidermal growth factor receptor, EGFR）信號轉導途徑和microRNA在肺癌的發生和發展中均起著重要的作用，為了研究miRNA在EGFR信號轉導途徑中的作用，他們應用miRNA芯片檢測發現miR-125a-5p為EGFR信號途徑的下游作用因子。進一步研究發現，miR-125a-5p能夠抑制肺癌細胞的遷移和侵襲。此外，miR-125a-5p還可調節EGFR信號通路中多個下游基因的表達。檢測肺癌樣本中miR-125a-5p的表達水平，結果顯示miR-125a-5p抑制和肺癌的發生顯著相關。證明了miR-125a-5p是一個受EGFR信號途徑調節的腫瘤轉移抑制因子。

2.5 miR-126 Crawford等[40]研究發現，在肺癌細胞中Crk蛋白可能為miR-126的靶蛋白。Crk可通過參與調節受體酪氨酸激酶和整合蛋白等多種分子的信號轉導通路，而改變細胞的粘附、增殖和遷移能力，增加Crk的表達可以促進腫瘤細胞的侵襲性。他們在肺癌細胞系中過表達miR-126后，抑制了Crk的蛋白表達水平，但對其mRNA表達水平無影響。過表達miR-126的肺癌細胞表現出粘附、遷移和侵襲能力的下降。證明了miR-126通過部分調節Crk抑制肺癌細胞的粘附、遷移和侵襲表型。

2.6 miR-221&222 Garofalo等[41]發現，在TNF相關凋亡誘導配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL）抵抗的非小細胞肺癌細胞中，miR-221和miR-222表達水平升高。最近的研究[42]發現，在非小細胞肺癌和肝癌細胞中，miR-221&222在侵襲性腫瘤細胞的表達水平顯著高于低侵襲性腫瘤細胞和/或正常細胞中的表達水平。進一步研究發現MiR-221&222通過作用其靶基因腫瘤抑制因子PTEN和TIMP3，誘導TRAIL抵抗，并通過激活AKT通路和金屬蛋白酶促進細胞遷移。還發現癌基因MET可通過調控c-Jun轉錄因子激活miR-221&222的表達。

2.7 miR-17-92 miR-17-92家族在肺癌尤其是小細胞肺癌中高表達，在肺癌發生發展中起到原癌基因的作用。將miR-17-92在A549細胞中過表達后，細胞的增殖能力顯著提高，而將它的成員如miR-18a、miR-19a、miR-20a單獨轉染至A549中并不能促進細胞增殖，表明miR-17-92家族作為一個整體發揮作用[43]。目前，對于miR-17-92家族在肺癌細胞中的作用機制尚不完全清楚。Lewis等[44]推測抑癌基因ΡTEN和RB2可能為miR-17-92家族的靶基因，其塔腫瘤研究中發現miR-17-92家族能與癌基因Myc協同作用[45]。已有研究[46]證實，p-Akt的過表達和PTEN的低表達與非小細胞肺癌的遷移和侵襲密切相關，提示 miR-17-92可能通過調控PTEN的表達促進肺癌細胞的侵襲和轉移。

2.8 miR-1 Nasser等[47]研究發現micro-RNA-1（miR-1）在正常肺組織中表達，而在人原發肺癌組織和肺癌細胞中低水平表達。原位雜交實驗結果顯示miR-1定位于支氣管上皮細胞，在肺癌細胞中，腫瘤抑制因子C/EBPα和組蛋白脫乙酰酶抑制劑可以重新活化的miR-1的表達，在肺癌細胞中miR-1表現為抑癌基因的作用。在不表達miR-1的A549和H1299細胞中過表達miR-1后，將穩定轉染的肺癌細胞接種裸鼠，成瘤實驗顯現miR-1過表達后，A549 和H1299細胞的成瘤性、腫瘤生長和轉移性均受到了顯著的抑制。同時研究還發現，miR-1過表達可顯著下調原癌基因MET、Ρim-1、FoxΡ1和HDAC4的表達水平。

3 結語

闡明miRNAs的功能和作用機制，有助于在轉錄后水平上深入研究基因表達調控，而且有助于從新的角度和層面詮釋人類疾病發病機制，并由此尋求新的、更有效的診治方法。已有的研究結果表明miRNA作用機制的復雜性，如一個miRNA可以同時調控多個靶基因，一個靶基因也可以同時受到多個miRNA的調控，同時miRNA可以受到一些細胞因子及甲基化等表觀遺傳學機制的調控等。迄今為止，仍有許多與腫瘤轉移相關的miRNAs未被發現，許多miRNAs的功能及其在腫瘤侵襲轉移中的機制還有待研究。在臨床上，如何應用miRNAs調控轉移表型理論與模式，對腫瘤轉移進行早期診斷和治療仍存在許多未知有待深入探究。