ERCC1和PKCalpha在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義

何朗 侯梅 李光明 文世民 楊紅 陳萍 徐聶

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的80%，其治療和預后至今仍無突破性進展，故診斷和治療NSCLC一直是人們關注的熱點。剪切修復偶聯因子1（Excision-Repair Cross-Complementing 1, ERCC1）是核苷酸外切修復家族中的重要成員，也是核苷酸切除修復（Nucleotide excision repair, NER）途徑的關鍵基因，它在核酸損傷修復過程和凋亡過程中起著重要作用。蛋白激酶C-α（Protein kinase Calpha, PKCα）是蛋白激酶C（Protein kinase C, PKC）的一種同工酶，是蛋白激酶超家族中的成員，多數報道認為PKCα所介導的信號途徑是腫瘤細胞中一種重要的信號途徑。本研究采用immunohistochemistry（IHC）分析ERCC1和PKCα在NSCLC組織、癌旁組織中的表達，以初步探討兩者的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 標本來自于四川大學華西醫院住院手術的51例NSCLC患者的術后腫瘤標本和相應的21例癌旁組織標本（癌旁肺組織取材距腫瘤邊緣5 cm以上）（2001年1月1日-2002年5月31日），術前均未行抗腫瘤治療。其病例資料通過醫院病案科和隨訪獲取，隨訪率100%。隨訪以病理確診之日起逐月記錄，隨訪5年。

1.2 主要抗體及試劑 鼠抗人ERCC1單克隆抗體（ZMED公司，產品編號ZM-0138）；鼠抗人PKCα單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術公司，產品編號Sc-8393）；Sp-9000通用SP Kit免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司）；第二代即用型免疫組化ElivisionTMplus廣譜試劑盒（福建邁新生物技術公司）。

1.3 實驗方法 本實驗采用IHC進行ERCC1及PKCα的檢測，預實驗得出ERCC1最佳IHC方法為兩步法（Elivision，過夜），枸櫞酸高壓鍋修復，工作濃度為1:50；PKCα為LsAB法，EDTA水浴修復，工作濃度為1:50。ERCC1的陽性對照采用強陽性表達組織扁桃體，著色為細胞核；PKCα采用結腸癌組織作為陽性對照，著色為細胞漿。

1.4 結果判定 ERCC1呈細胞核棕黃色顆粒沉著（圖1），參照Wachters[1]的標準：高倍視野（×400）下隨機計數300個腫瘤細胞，腫瘤細胞核不染色或染色陽性細胞數＜10.0%為陰性（-）；＞10.0%判定為陽性（+）。PKCα表現為胞漿內棕黃色顆粒積聚（圖2），參照許良中[2]的標準：染色強度分為無色（0），淡黃（1），棕黃（2），棕褐（3）；染色百分比分為陰性（0），陽性細胞≤10.0%（1），11.0%-50.0%（2），51.0%-75.0%（3），＞75.0%（4）；兩者乘積值為：0-3（-），4-5（+），6-7（++），＞8（+++）。

1.5 統計分析 采用SPSS 13.0統計分析軟件，率的比較采用χ2檢驗，Spearman等級相關分析兩因子間關系。Ρ＜0.05為差異有統計學意義。

圖 1 ERCC1在中分化肺鱗癌胞核中的陽性表達（Elivision, ×400）Fig 1 the positive expression of ERCC1 in nucleus of moderately differentiated squamous cell carcinoma of the lung (Elivision, ×400)

圖 2 PKCα在中分化肺鱗癌胞漿中的陽性表達（LsAB, ×400）Fig 2 the positive expression of PKCα in cytoplasm of moderately differentiated squamous cell carcinoma of the lung (LsAB, ×400)

2 結果

2.1 臨床參數 51例NSCLC患者年齡為37歲-82歲，中位年齡為60歲。分別參照2003年WHO肺癌的組織學分類標準和1997年肺癌的UICC分期標準，其中III期18例（IIIb期患者4例，術前分期為IIIa期，術后為IIIb期），IV期5例（包括T3N2M1患者2例與T2N2M1患者1例，為局限性腦轉移；余2例患者術前診斷為IIIa期，術中發現另一肺葉內存在單個轉移性腫瘤結節，術后病理證實為IV期）（表1）。

表 1 51例NSCLC患者臨床病理特征Tab 1 the clinical parameter in 51 patients of NSCLC

2.2 ERCC1、PKCα在NSCLC中的表達 NSCLC中ERCC1陽性率為58.8%（30/51），癌旁組織中陽性率為23.8%（5/21），兩組陽性率間存在統計學差異（Ρ=0.007）。NSCLC中PKCα陽性率為74.5%（38/51），癌旁組織陽性率為42.9%（9/21），兩組間存在統計學差異（Ρ=0.010）。ERCC1表達率證實與不同的臨床分期、N分期相關，與性別、年齡、有無吸煙、組織學分型、分化程度、T分期和腫瘤部位等臨床病理特征無關，臨床III+IV期及N1-2期患者ERCC1表達率要分別高于I+II期和N0期患者（Ρ=0.011和0.015）。PKCα證實與臨床各參數間均無關系（Ρ＞0.05）。

2.3 ERCC1、PKCα染色狀態與術后5年生存時間關系 5年隨訪，生存期＜5年患者為28例，ERCC1陽性率為71.4%（20/28）；≥5年患者為23例，ERCC1陽性率為43.5%（10/23），χ2檢驗證實ERCC1陰性組5年生存時間高于陽性組（Ρ＜0.05）；而PKCα陽性組的5年生存時間與陰性組比較并沒有差別（Ρ＞0.05）（表2）。

表 2 ERCC1、 PKCα陽性組和陰性組5年生存時間的比較Tab 2 the relationship about 5 years survival between positive group and negative group of ERCC1/ PKCα in NSCLC

2.4 ERCC1及PKCα之間的關系 Spearman相關分析（秩相關分析）發現ERCC1與PKCα之間存在正相關（r=0.425,Ρ=0.002）。

3 討論

ERCC1是核苷酸外切修復家族中的重要成員，在核酸損傷修復過程中起著重要作用，人類的ERCC1基因具有5′-3′核酸內切酶的活性，故ERCC1缺乏的細胞不能進行鉑類-DNA加合物的修復。目前ERCC1與腫瘤的關系正成為研究的熱點，已有研究[3]證實它可能與腫瘤的發生密切相關。我們通過IHC發現NSCLC標本中ERCC1陽性率為58.8%，此結果與Takenaka[4]關于NSCLC、Kwon[5]關于晚期胃癌的IHC結果類似，我們的發現支持ERCC1在腫瘤組織中高表達，提示ERCC1可能與NSCLC的發生發展相關。

針對ERCC1與臨床參數的關系，本研究發現ERCC1在臨床III+IV期及N1-2期患者中高表達，說明ERCC1的陽性狀態可能同腫瘤的侵襲性和淋巴結轉移關聯。而Takenaka[4]證實ERCC1陽性表達與肺鱗癌關聯；Olaussen[6]發現ERCC1表達與患者的年齡、性別、病理類型、胸膜受侵和脈管受侵等明確相關。從上述結果可以看出不同的試驗得出了不同的結果，這些差異可能與試驗不同的樣本量、樣本來源以及不同的試驗方法有關，故ERCC1與臨床參數間的確切關系尚有待大規模的臨床試驗以明確。對于ERCC1與預后的關系報道各異，已證實ERCC1 mRNA的高表達預示卵巢癌患者疾病進展的高度風險[7]。而我們的研究結果與多數結論[8,9]類似，支持ERCC1陰性狀態可能與較好的預后相關。但也有不同的結果，Zheng[10]即認為ERCC1高表達者的生存時間較長，故ERCC1與NSCLC之間的關系仍需進一步研究。

PKC是細胞內重要的信號轉導分子。PKCα屬于經典型PKC[11]，是PKC的一種同工酶。近來的研究[12]結果表明，腫瘤組織中PKCα活性明顯增加[12]，其異常表達和活化能促進腫瘤細胞的增殖，抑制細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的分化。本實驗發現NSCLC中PKCα陽性率為74.5%，在腫瘤組織中高表達，與Lahu[13]和高志強[14]的研究結果類似，這提示PKCα可能參與了腫瘤的發生發展。Byers[15]發現特異性siRNA靶向敲除ΡKCα基因能夠有效抑制黑素瘤細胞的遷移，說明PKC的效能和表達水平是腫瘤進展的關鍵因素，但我們的結果卻顯示出PKCα的染色狀態對生存并沒有影響（Ρ＞0.05），我們認為尚沒有依據支持PKCα的表達與NSCLC的生存預后相關。

ERCC1能夠識別、切除和修復損傷DNA片段，缺乏ERCC1的細胞會產生DNA修復缺陷，誘發細胞的凋亡反應；PKCα與正常細胞的新陳代謝密切相關，與腫瘤細胞的增殖和細胞凋亡的抑制也有關。到目前為止，國內外尚無這兩種基礎作用機理不同的檢測指標聯合運用的報道，考慮到這兩種指標可能具有的一些聯系，我們初步探索了兩者之間的關系，我們發現ERCC1與PKCα之間存在正相關（Ρ=0.002），分析可能在腫瘤細胞DNA損傷修復過程與PKC信號傳導途徑間存在共同通路，從而產生協同或相加效應，對該相關性的進一步深入研究，可能會給NSCLC的治療提供一條新的途徑和一種新的思維。我們的研究表明ERCC1與NSCLC發生和預后相關，且ERCC1與PKCα正相關，但卻發現PKCα只與NSCLC的發生相關而與其預后無關，這一看似矛盾的結果可能與不同的實驗方法及我們較小的樣本量有關，進一步大樣本前瞻性研究可能會更清晰明確兩者在NSCLC中所扮演的角色及相互關系，因此還需要不斷的探索和驗證。