E-鈣粘蛋白復合體與肺癌的侵襲轉移

王洪濤 綜述 周清華 審校

肺癌是發病率和死亡率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。腫瘤的侵襲轉移是其惡性特征和標志，也是肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤細胞從原發部位脫落、遷移是腫瘤轉移的重要環節，這一過程與腫瘤細胞間粘附功能的降低密切相關。由上皮型鈣粘蛋白（E-cadherin）與其胞內域相連接的β-連環蛋白（β-catenin）構成的E-鈣粘蛋白-連環蛋白復合體（E-cadherin/catenin）是細胞間粘附分子的重要部分，在抑制肺癌的侵襲轉移過程中發揮著極其重要的作用。本文就E-鈣粘蛋白復合體的構成及其與肺癌侵襲轉移的關系做一綜述。

1 E-鈣粘蛋白復合體的構成

E-鈣粘蛋白是一種介導同質細胞間相互粘附的Ca2+依賴性跨膜糖蛋白，主要分布于上皮組織中，其基因CDH1定位于染色體16q22.1，cDNA全長48 kb，在胞質內先合成135 kDa的蛋白前體，經剪切修飾成熟后轉移至細胞膜發揮其生物等功能。E-鈣粘蛋白的胞外區是由5個串聯重復的結構單元構成，每個結構單元大約含有110個氨基酸殘基，相鄰的重復結構單元之間是Ca2+的結合位點，其中第一個重復序列（最外側）包含一個“組-丙-纈”（HAV）三肽的模體，它決定著E-鈣粘蛋白與同質細胞間的特異性識別和相互作用?？缒^由32個氨基酸組成的疏水結構域。E-鈣粘蛋白的胞內域含有SH1和SH2區：SH1區可以和β-連環蛋白（γ-連環蛋白）直接結合；SH2區和p120ctn結合，發揮調節粘附分子二聚體聚集和解離的作用（圖1）。

β-連環蛋白是一種胞內可溶性的多功能蛋白，編碼β-catenin的基因為CTNNB1，定位于染色體3p21上，全長為23.2 kb，由781個氨基酸組成，分子量約為92 kDa。肽鏈的中部有12個-14個各由42個氨基酸殘基組成的重復序列（稱arm區域），該區域可以和多種蛋白受體結合而發揮功能。β-連環蛋白在細胞內存在有兩種形式：①游離型：主要存在于細胞漿中，通過與大腸腺瘤樣息肉蛋白（adenomatous polyposis coli, APC）、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）和軸蛋白（axin）形成的“破壞復合物”結合后被GSK-3β和酪蛋白激酶1α（casein kinase 1, CK1α）磷酸化，進而泛素化被蛋白水解酶降解，從而使其在細胞漿中維持一個較低的水平；②結合型：β-連環蛋白由胞漿轉移至細胞膜下和E-鈣粘蛋白形成復合體，參與細胞之間的粘附，進入細胞核的β-連環蛋白與T細胞因子/淋巴細胞增強因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor, Tcf/LEF）結合參與細胞內基因的表達，引起細胞的增殖，但磷酸化的β-連環蛋白進入細胞核后，雖能與TcF/LEF相互作用，卻不能和DNA結合，無法啟動相應靶基因的轉錄[1]（圖2）。

E-鈣粘蛋白復合體的形成過程是在E-鈣粘蛋白穿膜時開始的，首先β-連環蛋白（γ-連環蛋白）和E-鈣粘蛋白的胞內肽段結合，然后在胞膜上α-連環蛋白與β-連環蛋白（γ-連環蛋白）的氨基端結合而將E-鈣粘蛋白復合體錨定在肌動蛋白細胞骨架上。細胞膜上與E-鈣粘蛋白結合的β-連環蛋白可以和細胞漿內的β-連環蛋白相互交換，這種交換形成一種平衡狀態，并由此調節同質細胞之間的粘附作用。

圖 1 E-鈣粘蛋白的結構和功能域Fig 1 the structure and function domains of E-cadherin

圖 2 β-連環蛋白在細胞內的功能和分布Fig 2 the function and distribution of β-catenin in the cell

2 E-鈣粘蛋白復合體在肺癌侵襲轉移中的作用

E-鈣粘蛋白是參與細胞之間粘附連接的主要分子，發揮著維持細胞極性和組織結構完整性的功能，它的抑癌作用主要是通過與β-連環蛋白形成復合體介導同質細胞之間的相互粘附，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲性，同時E-鈣粘蛋白競爭性和β-連環蛋白結合，降低細胞內游離型β-連環蛋白水平，從而抑制其參與Wnt信號通路細胞增殖基因的表達[2-4]。E-鈣粘蛋白復合體中無論鈣粘蛋白本身或其組分的異常變化都可能引起細胞之間的粘附能力減弱以及腫瘤細胞的運動能力增強，從而導致細胞容易脫離、侵襲和轉移[5]。

近年來的研究發現，在肺癌的侵襲與轉移過程中E-鈣粘蛋白復合體功能異?？赡芡ㄟ^以下幾個環節參與肺癌侵襲轉移的調控。

2.1 基因突變 基因突變是引起蛋白表達水平改變和功能障礙的主要機制之一，在多種惡性腫瘤的研究[6]中發現，E-鈣粘蛋白基因的點突變、缺失均可導致E-鈣粘蛋白表達水平的下調和功能結合區域的改變，從而引起細胞-細胞之間連接疏松。陳曉峰等[7]應用聚合酶鏈反應和單鏈構象多態性分析技術對53例非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）原發灶組織和5例肺部其他良惡性病變組織中的E-鈣粘蛋白基因突變情況進行檢測，結果顯示僅3例NSCLC發生E-鈣粘蛋白基因突變，E-鈣粘蛋白基因的突變率在肺癌和非肺癌之間無統計學差異。目前，在肺癌組織細胞中有關E-鈣粘蛋白基因突變的文獻報道較少，且突變發生率亦較低，據此推測E-鈣粘蛋白基因突變在肺癌的侵襲轉移過程中可能不是主要事件。

有研究顯示β-連環蛋白基因的變異可以使細胞之間的粘附能力下降。當前對β-連環蛋白基因突變的研究主要集中于基因外顯子3（外顯子3的第33、37、41、45位密碼子編碼區域，構成連環蛋白氨基末端糖原合成酶激酶-3β和酪蛋白激酶1α的磷酸化位點，是β-連環蛋白正常被磷酸化后降解維持細胞內低水平狀態所必需的），當其出現缺失或變異時不僅影響其參與的粘附功能，同時會導致β-連環蛋白與GSK-3β結合障礙而不能被降解，在細胞內異常積累并轉移至細胞核，激活異常的Wnt信號通路，從而促進細胞增殖[8]。李利亞等[9]應用PCR-SSCP和DNA測序的方法對36例NSCLC術后標本進行β-連環蛋白外顯子3的突變分析，結果顯示β-連環蛋白基因外顯子3有突變，在我國其突變率較國外報道高；并且β-連環蛋白基因外顯子3的突變與NSCLC的淋巴轉移和腫瘤的分化程度相關，提示β-連環蛋白基因外顯子3的突變可能與NSCLC轉移密切相關。

2.2 甲基化 CpG島異常甲基化是腫瘤抑制基因失活的主要機制之一，CpG島高度甲基化可能改變染色體局部構象，從而阻止轉錄因子與相應啟動子的結合來抑制轉錄過程，E-鈣粘蛋白啟動子區域的CpG島異常高度甲基化會導致CDH1基因轉錄失活而引起E-鈣粘蛋白表達的下調。一般認為啟動子甲基化引起的E-鈣粘蛋白表達下調是動態變化的，原發腫瘤發生侵襲時啟動子區發生高度甲基化，此時E-鈣粘蛋白表達下降；當侵襲轉移的腫瘤細胞到達一個適合其定居的環境后，啟動子甲基化水平可顯著下降，E-鈣粘蛋白表達水平可恢復，便于細胞粘附形成轉移灶。Wang等[10]對95例NSCLC腫瘤組織標本檢測發現CDH1基因在腫瘤組織中出現甲基化的頻率比相應腫瘤周圍組織顯著增高，同時檢測CDH1基因的甲基化程度與E-鈣粘蛋白表達水平的降低相關。王紅兵等[11]應用甲基化特異性PCR技術檢測22例肺癌組織、相應的癌旁組織和9例正常肺組織中E-鈣粘蛋白基因啟動子CpG島甲基化水平，結果顯示肺癌中E-鈣粘蛋白基因啟動子CpG島完全甲基化率為13.6%（3/22），部分甲基化率為27.3%（6/22），總甲基化率為40.9%（9/22），顯著高于相應癌旁組織中該基因的甲基化率［9.1%（2/22）］；9例正常肺組織中該基因未發生甲基化，提示E-鈣粘蛋白啟動子異常甲基化可能是肺癌侵襲轉移中的常見事件。亦有較多文獻[12-14]報道E-鈣粘蛋白基因甲基化水平可作為評估肺癌浸潤轉移和預后的有效指標。

2.3 E-鈣粘蛋白基因轉錄抑制 基因的轉錄抑制是E-鈣粘蛋白表達下調的重要機制。人E-鈣粘蛋白啟動子區域存在的E-box含有保守的5′-CACCTG序列，該序列為helixloop-helix（HLH）轉錄因子家族的結合位點。在上皮腫瘤細胞中，當E-鈣粘蛋白基因啟動子的E-box結合轉錄抑制因子后可下調E-鈣粘蛋白的表達。這些轉錄抑制因子有Slug[15]、Twist[16]、Snail和ZEB[17]等，其中Snail和ZEB因子與羧基末端連接蛋白（C-terminal-binding proteins,CtBPs）結合后可以恢復去乙酰化酶活性，使染色質核小體的構象處于緊縮狀態，因此不能和DNA結合而抑制E-鈣粘蛋白基因的表達。此外，這些轉錄抑制因子和CDH1基因的啟動子結合，能夠誘導上皮細胞向間質細胞表型的轉化（epithelial-mesenchymal transition,EMT），同時伴隨E-cadherin向N-cadherin轉化，使腫瘤細胞獲得侵襲的能力[18]。

2.4 磷酸化和糖基化 蛋白分子晶體結構分析顯示：β-連環蛋白中心區域由12個arm重復結構形成一個超螺旋的環，形成一個帶正電的溝，能結合帶負電的鈣粘蛋白受體、降解復合體以及LEF/TEF轉錄因子。因此，當E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白發生異常磷酸化時將改變分子的帶電性和（或）分子的空間構象，影響復合體的正常形成和功能。β-連環蛋白的酪氨酸磷酸化可引起β-連環蛋白和E-鈣粘蛋白分子之間相互作用的破壞，致使細胞內游離的β-連環蛋白水平增高[19-20]，而β-catenin被絲氨酸/蘇氨酸磷酸化后能夠增強β-連環蛋白和E-鈣粘蛋白的相互作用[21]，進一步研究發現：β-連環蛋白的第654位酪氨酸磷酸化能降低β-連環蛋白和E-鈣粘蛋白的結合力而促進β-連環蛋白和TATA連接蛋白的協同作用[22]，β-連環蛋白的第142位酪氨酸磷酸化則能降低β-連環蛋白和α-連環蛋白的相互作用[23]。β-連環蛋白的功能和酪氨酸激酶的活性有密切關系，酪氨酸激酶的激活能夠增強細胞核內β-連環蛋白的信號[24]，相反酪氨酸激酶的失活能夠增強β-連環蛋白和E-鈣粘蛋白的結合而相應降低TCF/β-catenin調節的基因轉錄——在酪氨酸磷酸化的β-連環蛋白經去磷酸化藥物（geldanamycin）處理后，酪氨酸磷酸化的水平降低并促進它和鈣粘蛋白的相互作用，致使細胞運動能力的降低[25-26]。對于E-鈣粘蛋白，有研究[27-28]顯示當其胞漿域被GSK-3β或CK-II磷酸化時，可調節E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白之間的親合力，最終增強細胞之間的粘附作用，可能與其帶電荷的改變有關。另外，文獻[29-30]報道E-鈣粘蛋白糖基化后可以改變細胞之間的粘附作用，E-鈣粘蛋白介導的細胞之間的粘附能力在其糖基化降低時增強而糖基化升高時減弱，結構模型顯示E-鈣粘蛋白核心巖藻糖基化（core fucosylation）可以改變E-鈣粘蛋白的三維構象，其介導的細胞間粘附功能受到抑制，使肺癌細胞的轉移性增高。

2.5 細胞內異常分布 人們通常認為E-鈣粘蛋白表達升高會降低腫瘤細胞的侵襲轉移力，相反E-鈣粘蛋白表達下降會導致轉移潛能的提高，并得到實驗證實。但有報道[31-34]認為，E-鈣粘蛋白表達較高的腫瘤仍具有較高的侵襲轉移能力，可能是由于E-鈣粘蛋白不能正常定位于細胞膜上，從而喪失粘附功能。細胞內異常分布可能是其中一個原因，亦有較多腫瘤細胞內兩者存在異常分布的報道。有研究[35]發現，在人支氣管肺癌中，E-鈣粘蛋白在細胞質內的重新分布可能與E-鈣粘蛋白酪氨酸磷酸化水平下調有關，但具體調節機制目前尚不清楚。β-連環蛋白在細胞膜和細胞核具有不同的生物功能，應用免疫組化方法對多數惡性腫瘤的研究結果大都顯示β-連環蛋白的細胞內異常分布：細胞膜上分布減少，出現核內的聚集[36,37]。在肺癌組織細胞中亦出現β-連環蛋白空間分布的異常[38]。

2.6 其他影響因素 p120-catenin是E-鈣粘蛋白復合體的一個重要調節蛋白，在和E-鈣粘蛋白結合時可以穩定E-鈣粘蛋白在細胞膜上的穩定性，當其和E-鈣粘蛋白解離后，E-鈣粘蛋白則易被內吞降解[34,39,40]。另外研究發現，nm23-H1基因在E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白的表達調控中起重要作用，將nm23-H1基因轉染肺癌細胞株L9981后能明顯上調E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白基因和蛋白的表達水平[41-43]，而應用siRNA干擾技術對肺癌細胞NL9980中的nm23-H1基因進行沉默后E-鈣粘蛋白基因的表達水平明顯下調[44]。

3 E-鈣粘蛋白復合體在肺癌中的異常表達與肺癌臨床特征的關系

大量的臨床研究[45,46]顯示E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白蛋白在NSCLC中有不同程度的分布異常和表達下調。Xu等[47]應用免疫組化的方法檢測了100例NSCLC中β-連環蛋白的表達，結果顯示80%的病例出現膜上表達的降低，26%的病例出現細胞核內異常表達。Kase等[48]對331例肺癌組織中E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白的表達進行分析，42%（138/331）的病例出現E-鈣粘蛋白的降低，37%（122/331）的病例出現β-連環蛋白表達降低。

許多研究已證明：E-鈣粘蛋白復合體的表達水平與肺癌的組織類型、分化程度及淋巴結轉移有關。唐小軍等[49]的研究顯示肺鱗癌組織中E-鈣粘蛋白、β-連環蛋白的表達水平顯著低于肺腺癌和腺鱗癌，而腺癌與腺鱗癌之間無明顯差異；低分化肺癌中E-鈣粘蛋白的表達低于中-高分化者，而β-連環蛋白的表達水平與分化程度沒有相關性；有淋巴結轉移（N1-3）以及III、IV期肺癌中的表達水平均分別低于無淋巴結（N0）和I、II期肺癌（Ρ＜0.01）。Choi等[50]應用組織微陣和免疫組化方法對141例術后I期肺癌標本中E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白的表達水平分析發現，E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白缺失或低表達分別達60%和45%，且鱗癌中的異常表達（72.5%）明顯高于腺癌（36.6%），兩者之間有明顯差異。Nozawa等[51]應用免疫組化的方法對35例肺癌組織中E-鈣粘蛋白復合體的表達進行分析，結果顯示復合體在膜上表達水平的降低與肺癌的低分化有明顯相關性，而與淋巴結轉移沒有統計意義的相關性。然而也有研究[52-54]顯示有淋巴結轉移的癌組織E-鈣粘蛋白、β-連環蛋白的表達明顯低于無淋巴結轉移組。E-鈣粘蛋白復合體在肺癌淋巴結轉移相關性的研究中出現的不同結果可能與研究方法、樣本量的大小及腫瘤的組織類型不同有密切關系。

E-鈣粘蛋白及其相關的β-連環蛋白在肺癌的預后方面已進行了廣泛的研究，E-鈣粘蛋白復合體的異常表達和不良預后成正相關[46,55]，E-鈣粘蛋白的異常是可以作為肺癌侵襲轉移和不良預后的一個獨立指標，多因素分析顯示連環蛋白表達水平低的患者生存期短[51]，免疫組化預后分析亦表明β-連環蛋白的低表達和不良預后相關[47,50-54]。

4 總結

綜上所述，E-鈣粘蛋白復合體表達下調或/和功能喪失與肺癌的分化、侵襲轉移和預后密切相關。E-鈣粘蛋白復合體在細胞膜上的形成和調控涉及到多種機制，尤其是β-連環蛋白結合型和游離型之間平衡狀態的調控，直接影響到其對腫瘤細胞的生物學作用，但這種復雜的調節機制目前還不甚清楚，仍需進一步的研究。最近研究[56]報道，吲哚美辛成濃度和時間依賴性地增加結腸癌細胞內E-鈣粘蛋白的表達，并使β-連環蛋白從細胞漿和細胞核內轉位到細胞膜上，增強細胞之間的粘附作用，這提示可以通過糾正E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白的表達和分布異常以增強細胞之間粘附作用的途徑來降低腫瘤細胞的侵襲轉移潛能，這也可能成為腫瘤治療的一個新靶點。因此通過對E-鈣粘蛋白復合體調控機制的進一步深入研究，將對闡明肺癌的侵襲轉移有著重要的意義，也將對肺癌的靶向治療提供一個新的思路。