熒光定量PCR用于胎兒非整倍體的產前快速診斷

苗明珠 綜述 孫麗洲 審校

（南京醫科大學第一附屬醫院婦產科，江蘇 南京 210036）

非整倍體異常是人類最常見的一類染色體數目異常，其中最常見的為三體征，常見染色體三體綜合征的發病率為1∶400［1］。最常見的非整倍體異常發生在21、18、13號常染色體及X，Y性染色體。這些異常主要包括21-三體綜合征（唐氏綜合征）、18-三體綜合征（Edward綜合征）、13-三體綜合征（Patau綜合 征）、45XO（Turner 綜 合 征）、47XXY（Klinefelter綜合征），約占產前診斷中有臨床意義的染色體異常的80%［2，3］。因此，做好對胎兒非整倍體的檢測一直是產前診斷的重要部分。

傳統的產前診斷方法為細胞遺傳學核型分析，是診斷染色體異常的金標準。方法是對羊膜腔穿刺獲得的羊水細胞或絨毛抽吸獲得的絨毛細胞進行培養，對染色體有絲分裂期的核分裂相進行分析。對所有的23對染色體都進行檢查，可以檢出包括染色體數目異常和染色體重排等結構異常在內的多種染色體異常，例如平衡或不平衡的染色體易位和染色體倒位。盡管核型分析為最有效的產前診斷方法，但是該方法需要高質量的專業人員且非常耗時，其結果報道的時間大約為10～14天［4］。據報道，在英國每20個孕婦就有一個需要進行產前診斷［5］。傳統的細胞遺傳學方法在產前診斷的發展中已受到限制，尋找快速、準確的產前診斷方法已成為當今產前診斷的研究熱點。對于我國這樣一個人口大國來講，尋求更快、更簡便的產前診斷方法更加重要及必需。目前我國進行產前診斷的指征主要有：高齡孕婦（≥35歲）、血清學篩查高風險、超聲探測的胎兒異常及父母一方或雙方有染色體異常的家族史。近年來，隨著高齡產婦的增加，以及孕婦外周血清學篩查的開展和超聲技術的發展，需要進行產前診斷的孕婦數量逐年增加［5］，因此，很有必要建立快速、簡便的非整倍體診斷方法應用于臨床。分子生物學技術的發展為尋求新的產前診斷技術提供了基礎。一些分子診斷技術已用于產前診斷領域，可做到快速診斷，通常在24～48小時內即可得到結果［1］。熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR）就是一種迅速發展的可用于快速產前診斷的分子生物學方法。1992年，日本人 Higuchi發明了該技術［6］。QFPCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法［6］。1993年Mansfield ES［7］首次報道了基于短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）的 QF-PCR 產前診斷技術，至今已經歷了近20年的發展。本文著重對QF-PCR在產前診斷非整倍體中的應用進行探討。

1 QF-PCR原理及背景

自從1983年Mullis發明聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）以來，PCR技術作為一種重要的基因診斷方法，以其迅速、簡便、靈敏等優點很快成為科研、臨床診斷的熱點技術。但是傳統PCR技術不能準確定量。為克服上述不足，人們采取了許多方法，如雜交法、酶聯法及尿苷酶降解法等，但均不能得到滿意的結果。直到1992年，日本人Higuchi［6］發明實時熒光定量PCR技術，該問題才逐步得到改善。他在原有的普通PCR儀的基礎上，加以改進，添加一個激發和檢測裝置，并通過在PCR反應液中添加染料溴化乙錠（EB）的方法，來實時監測整個PCR反應的全過程。隨著新的熒光染料和熒光標記探針的引入以及QF-PCR高靈敏度、高特異性和高精確性的特點，目前該技術已被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發等領域。

2 QF-PCR在非整倍體產前診斷中的發展

QF-PCR技術首次用于非整倍體的產前診斷源于1993年，Mansfield［7］應用基于STR的 QF-PCR技術診斷了21三體、18三體及X染色體數目異常。STR，是多型性的一種類型，指兩個或多個核苷酸重復排列，且不同的重復序列相鄰的形式，長度約2～10個堿基對，常見于非編碼的內含子中。由于重復單位及重復次數不同，使其在不同種族、不同人群之間的分布具有很大差異性，構成了STR遺傳多態性。不同個體之間在一個同源STR位點的重復次數不同，由此可應用基于STR的等位基因比判斷感興趣的染色體的拷貝數。Mansfield用于診斷的STR分別為21號染色體的D21S11，18號染色體的MBP的5’端的2個STR、X染色體的HPRT等。1994年，Pertl等應用相同的STR——D21S11，對134例樣本進行了診斷。除了2例無法判斷，其余正常樣本均顯示雙等位基因比接近1∶1，21三體樣本顯示為1∶1∶1的三等位基因比或2∶1的雙等位基因比［8］。當一種染色體只應用一個STR時，如果兩條同源染色體的STR相同，即為純合，就無法判斷該染色體的拷貝數。為了克服上述問題，在接下來的一系列研究中一些學者逐漸對一種染色體應用幾個STR，以提高雜合覆蓋率，進而減少無法判斷的情況［9，10］。經歷了近20年的發展，現在用于常見非整倍體診斷的STR，英國臨床細胞遺傳學協會（Association of Clinical Cytogenetics，ACC）已于2007年做了明確規定。

除了上述幾種非整倍體異常的診斷方法，1998年13三體綜合征也應用QF-PCR的方法首次成功診斷［11］。于是，QF-PCR在非整倍體的產前診斷中主要應用于21、18、13、X、Y幾種常見染色體異常的診斷。在QF-PCR首次報道用于非整倍體的產前診斷后，接下來的研究主要集中于其在幾種常見非整倍體異常產前診斷中的應用及單細胞方面［8，9，12］，并未對該方法的靈敏度及特異性進行系統的研究。直到2001年，一些大樣本的研究才開始對QF-PCR的靈敏度及特異性進行考察［13，14］。一系列的研究證實，QF-PCR對于非嵌合的非整倍體診斷的靈敏度和特異性均在90%以上［15-20］。在歐洲一些實驗室，QF-PCR已取代其他非整倍體快速產前診斷（rapid aneuploidy detection，RAD）方法，作為核型分析的一種輔助手段用于非整倍體的快速產前診斷。

3 QF-PCR用于非整倍體產前診斷的特點

3.1 優點

3.1.1 所需樣本量小、取樣孕周要求低 QF-PCR用于產前診斷所用的樣本可以是羊水、絨毛、胎兒血或胎兒組織，目前最常用的為羊水和絨毛。傳統的核型分析需要20mL的羊水，FISH需要5～10ml的羊水。用于QF-PCR的DNA可以從很少量的羊水中提取，文獻中報道的用量為0.5～5ml［21-25］，最多見的用量還是1～2ml［23］。其他樣本的用量為胎兒血5μL，1～2mm厚的胎兒組織層等［20］。用于PCR擴增的DNA主要提取自細胞，因此不要求細胞必須是未受損的或是活細胞。這就使該方法對樣本的取樣孕周無特定要求，可早在12周，或晚期34周時進行取樣，此時細胞活性對結果的可靠性沒有影響［13］。

3.1.2 快速 現在已認識到孕婦在等待核型分析結果的這段長時間內，心理上處于一種焦慮狀態［5］，對胎兒也會造成不良影響。因此減少等待時間、緩解焦慮也是RAD被應用的一個主要原因。QFPCR在獲取樣本后24～48小時即可獲得診斷報告，可顯著減少孕婦的等待時間［18］。如果結果正常，可早期緩解孕婦及家庭的焦慮；如果結果不正常，可繼續等待核型分析的結果，也可即時采取終止妊娠等處理措施。

3.1.3 自動化程度高 傳統的細胞遺傳學核型分析需要大量的人力，技術水平要求高，需要專業人員。一個有經驗的工作人員每年最多也只能完成250例核型分析［26］。而現在，在一個有DNA測序儀的實驗室條件下，每次每臺儀器可完成90份樣本的檢測［13］，甚至有的實驗室每次可完成96例［27］。QF-PCR可實現自動化，一個工作人員可完成的檢測量明顯多于核型分析。因此，每天可進行大量患者樣本的檢測。

3.1.4 可檢出母體細胞污染的樣本 母體細胞污染主要發生于侵入性產前診斷取樣過程中。肉眼可見的母血細胞污染的樣本，我們在處理時不難發現，但是對于一些肉眼無法辨別的污染樣本，在進行核型分析或FISH檢測時則會遇到一定的問題。當胎兒性別為男性時，母體細胞污染容易檢出，但當胎兒為女性時，母體和胎兒混雜的細胞則無法分辨。在對母體細胞污染的樣本進行QF-PCR檢測時，會出現兩種基因型，此時可獲取母體樣本進行擴增，與用于產前診斷的樣本進行仔細比較，可確定母體細胞的污染，但不能對欲進行診斷的樣本做出染色體情況的診斷［22，28］。

3.1.5 成本-效益 與細胞遺傳學核型分析不同，QF-PCR不需要細胞培養，也不需要FISH操作時復雜的處理程序及人力的消耗，因此其費用相對較低［5，13，17，21，23，28］。對我國的國情來說，也是一種可行的方法。

3.2 缺點

3.2.1 只能用于常見染色體異常 QF-PCR現在所用的STRs主要是針對21、18、13、X、Y等常見染色體的標記物，因此該方法目前只能用于這五類常見染色體數目異常的檢測［13］。對于其他目前仍沒有STRs標記物的染色體，現在還無法檢測。

3.2.2 對嵌合體的檢出還不是很靈敏 QF-PCR已被證實為可靠的、有效的用于診斷主要的三體征的方法，對于非嵌合體樣本沒有假陽性和假陰性的結果［16］。Celia Donaghue等［29］通過實驗評估了QF-PCR對嵌合體的檢出效力，并對檢出結果與核型分析結果的相關性進行了分析，所得出的結論是當異常細胞占整個樣本至少15%時，QF-PCR可對其嵌合狀態做出診斷。也就是說，QF-PCR并不能對所有嵌合狀態做出診斷，只有異常細胞達到一定比例時，才能做出診斷。

4 QF-PCR在非整倍體產前診斷中的應用

QF-PCR在產前診斷中的應用，仍存在一定的爭議。盡管所有報道都認為QF-PCR是一種經濟且快速的診斷技術，但對其準確性卻持有不同的觀點。一些學者認為，QF-PCR可作為傳統細胞遺傳學的一種輔助手段［9，13，30］。也有學者認為，如果將來胎兒細胞能從母體外周血中分離得到，QF-PCR可作為產前診斷非整倍體的一種不錯的選擇［10］，因為QF-PCR的應用僅需很小的樣本量，有報道最少可用10個細胞［31］。而Mann等［32］卻持有不同的觀點，他提倡個體化的產前診斷方案，即產前超聲異常或父母染色體異常者，建議核型分析；高齡孕婦或母體血清學篩查陽性者，可只進行QF-PCR診斷。近幾年，Ogilvie和Leung［33，34］建議用QF-PCR取代傳統的細胞遺傳學核型分析，他們認為該項技術的優點明顯大于缺點。

QF-PCR在非整倍體快速產前診斷中的研究主要在英國等一些歐 洲國家［20，25，35，36］，也有一些在亞洲人群中的研究［22，24，37］，而在美國的研究報道則很少［38］。英國從2007年開始已將QF-PCR作為非整倍體診斷的一種獨立方法，而不再作為核型分析的一種輔助手段。且英國ACC也于2007年底發布了QF-PCR用于非整體產前診斷的實踐指南，使其在此領域的應用更加規范化。關于QF-PCR在國內非整倍體產前診斷中應用的報道不是很多［22，37］。由于大部分這方面的研究都以國外人群作為研究對象，且STR的遺傳多態性在不同人群與不同種族之間的分布具有很大差異性，所以直接將國外研究的STR應用于國內人群的靈敏度與特異性還有待考察。中國應用QF-PCR于產前診斷領域，目前主要應基于國內人群的STR雜合率覆蓋的研究，以選取合適的STR標記用于國內人群的非整倍體診斷。

經歷了近20年的發展，QF-PCR在英國已作為獨立檢測手段應用于臨床。隨著此技術在非整倍體產前診斷中的逐漸應用，相應的商品化試劑盒也應運而生。目前用的最廣泛的試劑為ANEUFAST Multiplex QF-PCR Kit，與Chromoquant Version 2kit相比，該試劑盒的數據采集與結果分析都更加容易。

5 QF-PCR在非整倍體產前診斷中的展望

QF-PCR作為快速產前診斷的一種分子生物學方法，給現在的產前診斷帶來了巨大的發展前景。但其是否可以取代核型分析，作為一種最具成本-效益的單獨測試手段仍存在很大的爭議。在將來希望能將其與母血中游離胎兒核酸的非侵入性檢測手段結合起來，進行胎兒染色體異常的診斷。相信隨著QF-PCR方法的不斷發展與成熟，QF-PCR將發揮越來越大的作用。

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