甲型血友病的遺傳咨詢與產前診斷

張燕 綜述 王謝桐 審校

（山東大學附屬省立醫院婦產科，山東 濟南 250021）

甲型血友病是由于凝血因子Ⅷ（coagulation factorⅧ，FⅧ）的遺傳性缺陷或缺乏，以致凝血活酶生成障礙的一種常見X連鎖隱性遺傳性疾病，約占先天性出血性疾病的85%，是目前已經明確的單基因遺傳性疾病。男性患病率約為1／5 000，約60%患者有遺傳病家族史。目前本病尚無根治性措施，只能由凝血因子Ⅷ制品或新鮮全血預防和替代治療，但輸注血制品極有可能傳播傳染??；而且隨著使用FⅧ制品的時間延長，約2.4%～50%的患者會產生抗FⅧ的同種抗體［1，2］，大大降低了FⅧ的促凝血活性，使FⅧ的替代效果減低甚至無效，為家庭和社會帶來沉重的負擔。所以血友病攜帶者的檢測及早期診斷是有效控制致病基因傳遞，防止患兒出生，降低發病率的主要措施。血友病的產前診斷對于血友病家系的遺傳咨詢，減輕血友病家庭的經濟和心理負擔，具有重要的應用價值和社會效益。

1 甲型血友病的遺傳咨詢

甲型血友病是一種常見的X連鎖隱性遺傳性疾病，該病主要是女性傳遞，男性發病，多見隔代遺傳：① 甲型血友病男性患者與正常女性結婚，其兒子100%正常，其女兒100%為攜帶者，無甲型血友病患者出現；② 正常男性與甲型血友病女性攜帶者結婚，其兒子50%正常，50%為患者；其女兒50%正常，50%為攜帶者；③ 甲型血友病男性患者與甲型血友病女性攜帶者結婚，其兒子50%正常，50%發??；其女兒50%為攜帶者，50%發病；④ 正常男性與甲型血友病女性患者結婚，其兒子100%為患者，其女兒100%為攜帶者。

在甲型血友病的診斷中判斷女性攜帶者很重要，一般判斷女性攜帶者的方法有3種：① 肯定攜帶者：甲型血友病患者的女兒；生育2個或更多甲型血友病患者的母親；生育1個甲型血友病患者的母親，其家系中常有1個以上的甲型血友病患者。②可能攜帶者：某女性的母系成員中有甲型血友病患者，而她自己所生的兒子中無甲型血友病患者，或未生兒子；血友病患者的姊妹和她們所生的女兒；血友病甲患者的姨母和她們的女兒；1個兒子有血友病，而沒有其他家庭成員患有血友病的女性。③ 甲型血友病患者中，有近40%為散發病例，其母系中無他人患甲型血友病，但可檢測家系的基因情況，以發現攜帶者。

以前，血友病攜帶者是通過系譜分析和FⅧ活性（FⅧ：C）／血管性血友病因子抗原（vWF：Ag）的測定診斷的［3］，然而，僅能診斷出55%～60%的攜帶者。FⅧ基因是1個比較龐大的基因，其突變的異質性非常豐富，突變類型眾多，相互異質，且不存在種族和群體的特異性，甚至每1個甲型血友病家庭都有可能攜帶1種新的突變類型，使得該疾病的直接基因診斷難度較大。

2 甲型血友病的產前診斷

2.1 甲型血友病的基因突變位點

目前世界血友病網站、血友病A數據庫HAM STeRS已報道的突變有1 900多種，包括倒位、點突變、插入和缺失，而重型甲型血友病中22內含子倒位約占40%～50%［4］，其次為小片段缺失／插入（10.2%）和無義突變（9.3%），而大片段缺失（3%）、剪接位點有關的突變（2.6%）則較少見。最近Bagnall［5］報道，FⅧ基因內含子一斷裂引起的倒位，占重型甲型血友病的5%。中型和輕型血友病中，86%為錯義突變，此外還有5.8%患者未找到任何突變位點［6］。多數這些突變的發病機制尚不完全清楚。極少數患者即不存在內含子1或22倒位，也沒有點突變或插入和缺失，甚至對整個F8基因外顯子和與其相鄰的內含子序列測序后仍找不到基因突變位點，只能解釋為相應基因產物活性的缺失或減少，推測F8基因的不表達或表達不均衡及mRNA的快速降解是導致此類患者發病的病因［7-8］。

2.2 甲型血友病的產前診斷取材方法

2.1.1 臍帶穿刺術（cordocentesis） 妊娠中晚期（20～35周）B超引導下經腹抽取胎兒臍靜脈血，成功率高，也較安全［9，10］，使用此方法較多，優點是可以直接檢測FⅧ活性，不需要較高的實驗室技術，20世紀國外有報道用此法進行產前診斷，抽取胎兒血后提取DNA做基因診斷。

2.2.2 羊膜腔穿刺術（amniocentesis） 抽取羊水最佳時間是妊娠16～23周。此時羊水量多、胎兒浮動，穿刺容易，不易傷及胎兒?？梢灾苯訌难蛩刑旱拿撀浼毎麅忍崛NA作基因診斷。國內已有醫院開始使用此類方法對血友病進行產前診斷［11］。國外已有較多應用。

2.2.3 絨毛吸取術（chorionic villi aspiration sampling） 妊娠9～11周在B超監視下經宮頸取絨毛組織，絨毛枝與蛻膜嚴格分離后直接抽取DNA進行基因分析［12，13］。此方法的優點是若診斷為患者即可在孕早期終止妊娠，但流產風險稍高。

2.2.4 利用流式細胞術、梯度分離法、免疫磁珠分離技術等方法從孕婦外周血中分離胎兒細胞，這是1項非創傷性產前診斷技術，目前已成為研究熱點［14，15］。孕婦外周血中的胎兒細胞至少有3種，即滋養葉細胞、有核紅細胞和淋巴細胞，數量雖然不多，但已有用單克隆抗體或以滋養葉細胞表面特異性抗原的抗體作為標記等來識別胎兒細胞。目前這項技術正成為國內外研究的熱點，尚無臨床應用。

2.2.5 植入前診斷（preimplantation diagnosis）［16，17］胚泡植入前，利用微操作技術和DNA擴增技術進行檢測。目前已有用PCR技術作甲型血友病的產前診斷，雖然僅有個別成功先例，而且操作難度大，還不能用于臨床，但前景是可觀的。

2.3 臍帶血FⅧ活性檢測應用于甲型血友病產前診斷

胎兒期肝臟可以生成凝血因子，妊娠19周的胎兒血中已可測到FⅧ抗原。林琳華等［18，19］對264例19～36周胎齡的臍帶血進行了凝血因子活性測定，結果顯示妊娠中晚期正常胎兒的FⅧ活性為45%～80%，高于甲型血友病的診斷標準，提示了中晚期妊娠胎兒的臍帶血FⅧ活性測定可以作為甲型血友病高危胎兒產前篩查的可行性指標。由于FⅧ活性隨著胎齡的增長而升高，個別FⅧ活性低于30%的胎兒可能只是凝血因子合成器官發育不健全而已，容易被誤診，但其誤診率低于5%［19］，顯示出明顯的優越性。另Panigrahi等［9］在18～23周間應用臍帶穿刺術抽取臍帶血，用于血友病和地中海貧血的產前診斷，結果表明臍帶血檢驗結果和分娩后復查結果沒有偏差。15年來本院一直采用妊娠20～35周的胎兒臍帶血檢測FⅧ：C和vWF：Ag，篩查血友病患兒，結果和分娩后復查結果一致，生后至今隨訪結果無偏差。故認為妊娠20周以后的胎兒臍帶血可以用于血友病的產前診斷。北京朝陽醫院趙耘等［20］報道在他們醫院曾有1例胎兒血FⅧ：C為2%，但基因診斷為正常胎兒并隨訪1年FⅧ水平正常，但有無檢測的誤差尚不清楚。到目前為止尚未有明確的甲型血友病胎兒血FⅧ：C的診斷標準，還需要大樣本的試驗來證實。

2.4 基因檢測用于甲型血友病產前診斷

甲型血友病的產前基因診斷分為直接診斷和間接診斷。直接檢測法直接揭示遺傳缺陷，在無法獲得甲型血友病先證者DNA樣本及某些連鎖分析未能提供診斷信息時也能完成診斷，提高了診斷的可靠性。以往檢測內含子22倒位通常采用Southern印跡雜交技術，但此技術操作步驟繁多，流程長，出結果慢，難度大，且要操作放射性同位素標記的探針等，而LD-PCR技術則能簡便快速地檢測出FⅧ基因內含子22倒位，并能檢出攜帶者，進行產前診斷［21］。Bagnall等［5］建立了檢測內含子1倒位的雙管多重PCR的方法。對于較大的缺失、插入（＞50 bp），以及影響限制性內切酶識別位點的突變，一般用Southern印跡雜交方法檢測。對于單個堿基置換、小缺失或插入，則需對FⅧ基因的所有編碼區、側翼內含子序列及5′端和3′端UTR進行全面分析，設計37對引物擴增所有外顯子及其側翼內含子序列。隨著PCR的廣泛應用，單鏈構象多態性分析、異源雙鏈分析、變形梯度凝膠電泳、化學錯配切割、構象敏感凝膠電泳等結合DNA測序已被廣泛用于FⅧ基因突變的篩查。常用直接診斷方法有：

2.4.1 長距離PCR 目前國內外均有學者報道應用LD-PCR技術對內含子22進行診斷并取得滿意的結果，成為擴增內含子22倒位的首選方法。

長距離PCR（LD-PCR）引物設計及檢測FⅧ基因倒位的原理：22內含子含有兩個巢式基因（FⅧA和FⅧB），FⅧA在FⅧ基因上游約400kb及500 kb有2個同源拷貝（A2和A3），由于FⅧA1與FⅧA2、FⅧA3的高度同源序列長達9.5kb，倒位可發生在該9.5kb范圍內的任何位置，無法確定，因此必須把引物設計在9.5kb序列以外的非同源序列區。引物P、Q是只特異于IVS-22（22內含子倒位）中FⅧA 1的兩側各約1.2kb處的序列。引物A、B則是特異于FⅧA2、FⅧA3的兩側各約100～200bp處的序列。當同時使用4個引物，即P、Q、A、B進行LD-PCR時，如果模板基因組DNA沒有FⅧ基因倒位，那么將引物PQ及野生型FⅧ基因得到12kb的擴增帶，從FⅧA2、FⅧA3及引物AB得到10kb的擴增帶。如果模板基因組DNA是這種基因倒位的重型甲型血友病患者的DNA，從引物P和B將會得到11Kb擴增帶，引物A與Q也將發揮作用而產生同樣長度即11kb的擴增帶；同時，由于該基因倒位只改變了FⅧA2及FⅧA3中1個基因的結構，而另1個仍然保持野生型，因此A、B引物對仍能從這一野生型FⅧA模板擴增出10kb的產物，但無法得到12kb產物。如果模板DNA是來自1位女性攜帶者，則其LD PCR產物中將有11kb，12kb及10kb條帶。這3種擴增產物能夠用0.6%瓊脂糖凝膠電泳很好地分開。也有學者用P、Q、B及P、Q、A 3個引物的系統進行了一些研究，取得了滿意的結果。

2.4.2 直接測序法（direct sequencing，DS） 通過DNA自動測序儀對FⅧ基因直接進行測序，找出突變的確切位置，可提供最為準確的信息。目前，測序模板主要來源于PCR產物，將雙鏈PCR產物轉化為單鏈測序模板。DS是最直接、最準確的基因診斷方法，但是，由于是對整段基因進行測序，工作量大、時間長、限制了其在甲型血友病產前診斷上的廣泛應用［22］。

2.4.3 變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel ectrophoresis，DGGE） DGGE是1種根據DNA解鏈特性分離鑒定DNA片段的技術，利用野生型和突變型DNA在變性梯度凝膠電泳過程中遷移率不同來檢測基因突變。PCR／DGGE法很適合于大基因點突變的篩選，將PCR產生的雙鏈DNA在含濃度遞增的變性劑（尿素和甲酰胺）的凝膠上電泳。隨著DNA的遷移，具有序列依賴性的低解鏈溫度區的雙鏈漸漸打開，這部分的解鏈導致遷移率下降。發生突變的片段形成的異二聚體在較低的變性溫度下就發生變性，從而與正常條帶分離，實驗證明僅有1個堿基的替換即可用此法檢測出來，檢出泳動部位后行DNA測序。與SSCP相比，DGGE較可靠、精確，無同位素污染，且檢測的DNA長度增加。

2.4.4 單鏈構象多態性（single strand conformation polymorphism，SSCP） 近年常用PCR-單鏈構象多態性分析法（PCR-SSCP）。PCR產物變性后得到2條互補的單鏈，若其中任1條存在基因突變，其構象即改變，在非變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）中電泳的遷移率亦改變，借此找到突變位點。異源雙鏈分析法（heterodup lex analysis，HA）同SSCP方法相似，此法對于小片段DNA（小于300bp）的敏感性同SSCP。SSCP的優點是簡便易行，亦較敏感，只要基因突變影響了單鏈構象，小至單個堿基的改變即可被檢出。但其敏感性隨DNA長度增加而降低，受檢片段最適長度約為300bp，不超過350bp。

2.4.5 構象敏感凝膠電泳（conformation sensitive gel electrophoresis，CSGE） 原理是用多重PCR方法分別擴增FⅧ的各外顯子及其側翼和5′、3′區，然后與正常的PCR產物混和，發生突變的DNA片段形成異二聚體，在輕度變性的凝膠上電泳。插入、缺失和單堿基改變都會引起二聚體構象的改變，從而阻滯或促進異二聚體的電泳速度，與正常對照相比其電泳條帶發生改變。插入或缺失的片段越大，其條帶與正常條帶分開的距離越大。

2.4.6 變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatograthy，dHPLC）是1種新的高效的突變檢測技術，對FⅧ基因內突變的檢測率達96%。利用高效液相色譜原理，通過1個DNASep分離柱進行核苷酸片段的分離和分析。該法快速高效，易于自動化。正如SSCP、DGGE一樣，dHPLC不能確定突變的具體位置，但被檢片斷的長度可達1 500bp以上。

2.4.7 化學錯配裂解法（chemical mismatch cleavage，CMC）其原理是將同位素標記的野生型DNA分子和突變型的DNA（或RNA）片段混合變性，復性時可形成DNA-DNA或DNA-RNA異源雙鏈，然后對突變部位的錯配堿基進行化學修飾，氮雜環已烷在修飾位點可裂解標記的DNA片段，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及放射自顯影即可確定有無突變。

應用直接基因診斷方法雖然可檢測出大多數甲型血友病患者的基因突變，但一部分病例需要應用基因內外多態位點進行連鎖分析［23］，通過間接基因診斷尋找突變位點。間接診斷可適用的情況包括：① 曾做過多態性位點的連鎖分析，但未能找到突變位點的家系；② 不能確定或找不到基因的致病突變；③ 基因大部分缺失導致突變的家系。對于散發的血友病A家系，連鎖分析僅能在女性成員的多態性位點不同于先證者時，可以對女性成員排除其為攜帶者的診斷。常用的間接診斷方法：

① 限制性片段長度多態性法（restriction fragment length polymorphisms，RFLP）利用致病基因內外的限制性片段長度多態性（RFLP）作為特異分子遺傳標志物，通過家系成員間的連鎖關系確定血友病基因的遺傳情況，進行DNA多態性分析的遺傳學診斷方法［24］。RFLP通過與疾病基因的連鎖關系而直接分析，不需要分析基因產物，大大拓寬了基因定位范圍。但是，RFLP應用也有其局限性：首先必須具有先證者的標本；其次母親要求是該多態位點的雜合子；最后必須聯合多個RFLP才可診斷。FⅧ基因內共有四個基因內多態性位點：BclⅠ／內含子18、HindⅢ／內含子19、XbaⅠ／內含子22和BglⅠ／內含子25，和兩個基因外的多態性變異：TaqⅠ／位點DXS52（St14DNA檢驗）和BglⅡ／位點DXS15（DX13DNA檢驗）。其中最有信息的多態性位點為FⅧ基因BclⅠ和Xbal、TaqⅠ／St14。隨著PCR技術的日趨完善，現已使用PCR結合酶解進行限制性內切酶片段長度態性分析（PCRRFLP）取代了RFLP，成為臨床的對非倒位輕、中型甲型 血 友 病 的 產 前 診 斷 的 經 典 方 法 之 一［25，26］。PCR從方法上解決了RFLP的困難，但理論上仍無法提高RFLP多態位點的雜合性。

② 可變數目的串聯重復序列（variable number of tandem repeat，VNTR）又稱小衛星DNA，是人類基因組中種類多、分布廣又具有高度多態性的小片段重復序列，其長度多為60～70bp，是人類基因組中常見的1種多態標記，其應用十分廣泛，已報道2種VNTR：int13和stl4-1（DXS52）。其中St14位點內含VNTR多態序列，與FⅧ基因緊密連鎖，因此以此為遺傳標記可進行甲型血友病的基因診斷。DXS52（ST14）位點［27］是1個具有多個等位基因的可變數目串聯重復順序（variable number tandem repeat，VNTR）位點，女性的雜合頻率高，而且PCR擴增后可直接進行瓊脂糖電泳，簡便快速，但在進行結果分析和遺傳咨詢分析時不能忽視St14位點VNTR與FⅧ基因存在的重組率。

對于不存在內含子22倒位的家系進行攜帶者或產前診斷，利用基因多態性進行遺傳連鎖分析則成為重要手段。二核苷酸重復序列屬于微衛星的1種，作為第2代遺傳標記，廣泛地運用于遺傳性疾病的基因診斷和個體識別［28，29］。

間接診斷存在的問題主要有：① 缺乏家族史時，由于產生新的突變及嵌合體現象的存在，間接診斷可能是不正確的；② 家系中的先證者去世，不能提供有效依據的信息，連鎖分析往往不能進行；③當關鍵的家系女性成員如先證者母親在選擇的多態性位點上表現為純合子時，不能為連鎖分析提供有效信息，給連鎖分析帶來困難；④選擇的多態性位點可能與基因發生重組，會造成誤診。

血友病攜帶者診斷的目的是區別攜帶者及正常女性，使后者可以正常婚育及對攜帶者的胎兒進行基因檢測，以避免患兒出生。由于導致甲型血友病的FⅧ基因突變主要為內含子22倒位和異質性極強的點突變，因此，對于HA可疑攜帶者作基因診斷及產前診斷的方案，是比較合理的：先用LDPCR、多重PCR的方法檢測是否有倒位突變，這使近30%的患者得到直接診斷，對于對非倒位的重型甲型血友病患者和輕、中型甲型血友病的家系可用連鎖分析方法，最后對仍未能診斷的病例采取基因測序的方法，以便發現新突變。對于無家族史的或無先證者的，排除倒位后直接進行基因測序以求尋找突變位點。產前診斷的取材技術應根據孕婦的孕齡，家屬的要求，接受程度及經濟基礎等情況來選擇，做到因人而異，因孕周而異。

目前，本院主要是通過對妊娠20～35周血友病高危且懷有男性胎兒的孕婦進行產前診斷。于妊娠20～35周，在B超引導下行胎兒臍靜脈血穿刺術，血液離心后血漿測FⅧ：C，根據血漿FⅧ：C結果判斷胎兒是否為血友病高危兒。血細胞用于基因診斷，來驗證血漿FⅧ：C檢測結果的準確性，雖然實驗室基因診斷已較為成熟，但由于各種因素，本院尚未正式進行血友病的臨床基因診斷工作。

行產前診斷后的孕婦，根據產前診斷的不同結果給予不同的意見。FⅧ：C過低，及基因診斷結果異常的胎兒給予引產；FⅧ：C達到正常成人范圍的，及基因診斷結果正常的胎兒繼續妊娠。對于攜帶者，待其妊娠19周時先行B超檢查，如為女性胎兒則繼續妊娠，出生后行攜帶者診斷或妊娠后產前診斷，如為男性胎兒則進行胎兒血FⅧ：C檢測和基因診斷。

由于FⅧ基因分子量較大，目前僅了解其部分的基因序列，基因診斷仍會漏診部分患兒。血友病是1個終生疾病，現在尚無治愈方法，替代治療又給血友病患者帶來嚴重的并發癥，給家庭和社會帶來了沉重的經濟和心理負擔。因此認為有必要對血友病高危人群的孕婦進行積極的遺傳篩查和產前診斷，以減少血友病患兒的出生并減輕血友病家庭的經濟和心理負擔。

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