山羊膝關(guān)節(jié)僵直動物模型的建立

黃哲元,袁 志,衛(wèi) 磊,穆尚強,劉建敏,李鵬斌,闞成雙,李 巖,張 偉,于忠英

(第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院骨科,陜西西安 710032)

膝關(guān)節(jié)僵直常見于膝關(guān)節(jié)及其周圍組織結(jié)構(gòu)損傷或手術(shù)后長時間制動的病例[1]。臨床上通常采取功能鍛煉、理療和手術(shù)松解等治療,但仍有相當(dāng)多的患者治療效果并不理想。長期以來,對膝關(guān)節(jié)僵直的治療一直是骨科領(lǐng)域未能很好解決的一個世界性難題。而建立膝關(guān)節(jié)僵直動物模型是探索其有效治療新方法、解決該難題的重要一環(huán)。檢索相關(guān)資料,卻未發(fā)現(xiàn)理想的膝關(guān)節(jié)僵直動物模型,因此本研究擬使用雄性山羊建立膝關(guān)節(jié)僵直實驗動物模型,為下一步探索其相關(guān)有效治療方法提供模型基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實驗分組

成年雄性山羊 3只(第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供),年齡 18～24個月,體重 (30±5)kg。每只山羊?qū)⒆笙ピO(shè)為實驗組,行手術(shù)固定 8周;以右膝為對照組,未予手術(shù)固定。

2 模型制備

速眠新Ⅱ號注射液 (長春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 )0.2ml/kg肌肉注射麻醉,麻醉后取仰臥位并置于無菌臺。在左膝關(guān)節(jié)前側(cè)做 2～3cm的橫行皮膚切口,切斷髕韌帶,翻轉(zhuǎn)髕骨。用骨膜剝離器向近側(cè)剝離上關(guān)節(jié)囊,顯露股骨遠(yuǎn)側(cè)干骺端前側(cè),用骨挫將干骺端前側(cè)骨面及大腿前側(cè)肌群深面挫成粗糙面;屈曲膝關(guān)節(jié)以暴露上下關(guān)節(jié)面,用直徑2mm的克氏針在上下關(guān)節(jié)面對稱各鉆 4個骨洞直達(dá)干骺端松質(zhì)骨內(nèi),將髕韌帶重疊縫合;用 2mm直徑的克氏針交叉固定膝關(guān)節(jié)于伸直位,術(shù)畢管型長腿石膏加固膝關(guān)節(jié)于伸直位。術(shù)前及術(shù)后肌肉注射青霉素 20萬 U各 1次。術(shù)后回放飼養(yǎng)圈中繼續(xù)喂養(yǎng)。

3 膝關(guān)節(jié)活動度檢測

3.1 術(shù)后 8周(去除固定即刻),活體膝關(guān)節(jié)活動度測量:術(shù)后 8周,麻醉下拆除左膝長腿管型石膏,拔除克氏針。用長臂量角器,測量雙膝關(guān)節(jié)被動活動度范圍;另將肢端平伸后懸掛 2.0kg秤砣,測量雙膝關(guān)節(jié)相同垂直負(fù)荷下的屈曲角度。

3.2 術(shù)后 12周(去除固定 4周),活體膝關(guān)節(jié)活動度測量:去除固定后,將山羊置于飼養(yǎng)圈中自由活動4周。活動 4周(術(shù)后 12周)后,麻醉下用長臂量角器,測量雙膝關(guān)節(jié)被動活動度范圍;另將肢端平伸后懸掛 2.0kg秤砣,測量雙膝關(guān)節(jié)相同垂直負(fù)荷下的屈曲角度(見圖 1)。

圖1 去除固定 4周將山羊手術(shù)膝肢端懸掛 2.0kg秤砣后,仍保持僵直狀態(tài)

3.3 術(shù)后 12周(去除固定 4周),離體標(biāo)本膝關(guān)節(jié)最大屈曲角度:活體測量后立即將羊處死,切取雙膝關(guān)節(jié)標(biāo)本(留取關(guān)節(jié)遠(yuǎn)近側(cè)骨段約7.0cm),用 MTS880型材料測試機(MTS公司,美國)對比檢測雙膝標(biāo)本在 50Ncm屈曲的力矩下的屈曲角度。具體方法:將山羊處死,于脛骨和股骨在距關(guān)節(jié)線 7cm處截斷,切取雙側(cè)膝關(guān)節(jié);去除皮膚,保留所有肌肉、肌腱和關(guān)節(jié)囊。將測試機兩個夾具分別插入標(biāo)本的股骨和脛骨的髓腔,并用牙托粉固定;將夾具與材料測試機上下兩端連接。以 5mm/m in的加載速率給膝關(guān)節(jié)施加大小為 50Ncm屈曲的力矩,記錄雙膝關(guān)節(jié)的最大屈曲角度(見圖 2)。實驗過程中始終用生理鹽水保持標(biāo)本的濕潤。

4 取手術(shù)膝與非手術(shù)膝關(guān)節(jié)前側(cè)關(guān)節(jié)囊 5mm×5mm×5mm,常規(guī)甲醛固定,石蠟包埋,切片,進行免疫組織化學(xué)染色(見圖 3a、b)。光學(xué)顯微鏡下 400×觀察肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量及其占全部細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量的百分比。將手術(shù)膝與非手術(shù)膝進行比較,統(tǒng)計學(xué)方法采用配對 t檢驗。

圖2 以 5mm/min的加載速率給僵直膝關(guān)節(jié)施加50Ncm屈曲的力矩后所得的僵直角度

圖3 a、b分別為手術(shù)膝與非手術(shù)膝前側(cè)關(guān)節(jié)囊免疫組織化學(xué)染色切片(IHC, ×400)。黃色開放箭頭所指為血管組織,藍(lán)色實心箭頭所指為部分肌成纖維細(xì)胞?？梢娛中g(shù)膝前側(cè)關(guān)節(jié)囊較對側(cè)血管組織減少,肌成纖維細(xì)胞明顯增多

結(jié) 果

制動后山羊平均體重較前減少 5%。解除制動后,山羊體重逐漸恢復(fù)。3只山羊手術(shù)膝與非手術(shù)膝術(shù)后 8周及術(shù)后 12周分別測關(guān)節(jié)活動度(見表1、2)。其中術(shù)后 12周離體手術(shù)膝與非手術(shù)膝的最大屈曲角度通過 MTS880型材料測試機測得(見表3)。光鏡觀察結(jié)果顯示手術(shù)膝前側(cè)關(guān)節(jié)囊肌成纖維細(xì)胞的總數(shù)及其占全部細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量的百分比明顯多于非手術(shù)膝前側(cè)關(guān)節(jié)囊(P＜0.05)。

表1 術(shù)后 8周時活體膝關(guān)節(jié)活動度測量

表2 術(shù)后 12周時活體膝關(guān)節(jié)活動度測量

表3 術(shù)后12周時離體標(biāo)本膝關(guān)節(jié)最大屈曲角度

討 論

1 造模的目的

膝關(guān)節(jié)是人體最大最復(fù)雜的滑膜關(guān)節(jié),由股骨下端、脛骨上端和髕骨組成,骨與骨之間借關(guān)節(jié)囊、關(guān)節(jié)內(nèi)外韌帶和內(nèi)外側(cè)半月板相連,它有傳遞負(fù)荷、保存運動量和提供包括小腿在內(nèi)的活動動力匹配的功能。外傷和手術(shù)是造成關(guān)節(jié)僵直的重要原因,由于下肢骨折長期制動、膝關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍創(chuàng)傷或炎癥引起關(guān)節(jié)的滑動裝置纖維化、攣縮、黏連而導(dǎo)致其僵直、功能障礙。表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)屈曲受限甚至伸直位僵直,股四頭肌攣縮、彈性及活動度減小,髕骨活動度減小或消失。臨床常用的治療方法包括推拿按摩、手法松解、藥物、小針刀松解、股四頭肌成形術(shù)、關(guān)節(jié)鏡下黏連松解術(shù)等。但以上方法治療效果均不甚理想[2-4]。其中部分手術(shù)治療可能取得較好的短期療效,然而術(shù)中獲得的活動范圍往往在術(shù)后難以長期保持。因此,需要進一步探索一種能更簡便有效治療膝關(guān)節(jié)僵直的新方法。

根據(jù)膝關(guān)節(jié)僵直的臨床特點,我們設(shè)計制造了一種外固定架漸進牽拉裝置。該裝置利用杠桿、纜線與滑輪作用原理,通過外固定架及纜線對小腿遠(yuǎn)端進行緩慢逐步緊縮牽拉,使小腿以膝關(guān)節(jié)為軸隨時間漸進屈曲,達(dá)到膝關(guān)節(jié)屈曲活動范圍逐步增大的目的。其作用原理是在持續(xù)應(yīng)力作用下,引導(dǎo)組織發(fā)生生物再塑形。在投入臨床實驗之前,需要建立一種能適用的動物實驗?zāi)Ｐ?以驗證該器械的有效性。我們查閱了以往文獻報道的多種模擬人類關(guān)節(jié)僵硬的動物模型,物種包括兔、鼠、猴子和狗等[5,6]。但這些動物模型均為膝關(guān)節(jié)屈曲攣縮性僵硬,尚沒有膝關(guān)節(jié)僵直的動物模型。因此,我們選擇具有體型較大、實驗配合度高、抗病力強等優(yōu)點的本地雄性山羊制造膝關(guān)節(jié)僵直模型。

2 造模的方法和依據(jù)

導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵直公認(rèn)的損傷機制包括:(1)關(guān)節(jié)內(nèi)骨破壞、關(guān)節(jié)積血;(2)伸膝裝置(股中間肌)與股骨遠(yuǎn)端前側(cè)骨面疤瘢黏連;(3)韌帶損傷:(4)關(guān)節(jié)長期伸直位制動。臨床上關(guān)節(jié)僵直患者后期關(guān)節(jié)僵直的嚴(yán)重程度和初始關(guān)節(jié)周圍軟組織損傷程度呈正相關(guān)。因此我們嘗試通過以下程序制造出具有持續(xù)性僵直的膝關(guān)節(jié)動物模型。這一程序包括:(1)控制性關(guān)節(jié)內(nèi)骨破壞、關(guān)節(jié)積血(克氏針于關(guān)節(jié)面鉆孔);(2)用骨銼將伸膝裝置(特別是股中間肌)與股骨遠(yuǎn)端前側(cè)骨面造成損傷;(3)髕韌帶重疊縫合;(4)交叉克氏針聯(lián)合管型石膏伸直位固定關(guān)節(jié) 8周。

關(guān)節(jié)內(nèi)控制性骨破壞及關(guān)節(jié)積血既是關(guān)節(jié)僵直的主要原因,同時也是制造關(guān)節(jié)僵直動物模型的關(guān)鍵。過去傳統(tǒng)的造模方法是在動物膝關(guān)節(jié)股骨髁的兩側(cè)去除部分骨皮質(zhì)形成骨窗[7]。Fukui等[7]認(rèn)為這種方法既可以產(chǎn)生關(guān)節(jié)內(nèi)控制性骨破壞,還可以產(chǎn)生關(guān)節(jié)內(nèi)出血。在本實驗中,我們沒有采取以上在股骨髁部位開骨窗的方式制造骨折,而是直接用交叉克氏針在膝關(guān)節(jié)表面非負(fù)重面鉆孔。這種方法同樣可以達(dá)到制造穩(wěn)定性關(guān)節(jié)內(nèi)骨折并造成關(guān)節(jié)內(nèi)出血的目的,同時也簡化了操作的步驟。

由于創(chuàng)傷或手術(shù)導(dǎo)致的韌帶損傷以及伸膝裝置(股中間肌)與股骨遠(yuǎn)端前側(cè)骨面瘢痕黏連被認(rèn)為是導(dǎo)致人類多數(shù)急性關(guān)節(jié)損傷后關(guān)節(jié)僵直的原因之一。因此我們在造模過程中增加了對伸膝裝置(股中間肌)與股骨遠(yuǎn)端前側(cè)骨面的破壞。我們的結(jié)果顯示以上措施有助于膝關(guān)節(jié)僵直動物模型的建立。

多數(shù)損傷后出于緩解疼痛和減少炎癥反應(yīng)的需要常常對關(guān)節(jié)進行制動。但是延長制動對關(guān)節(jié)活動不利,大量的實驗研究和臨床證實,長期制動可產(chǎn)生結(jié)締組織攣縮外,還包括肌肉的萎縮、僵硬和變?nèi)?以及骨關(guān)節(jié)炎的形成,制動是其中主要的原因之一。有證據(jù)表明對關(guān)節(jié)內(nèi)骨折進行外固定處理的時間都＞8周。有實驗證明,5～10周的制動,關(guān)節(jié)僵硬的嚴(yán)重程度沒有明顯的差異[7]。因此我們選擇8周作為制動時間。目前已經(jīng)有多種制動方式應(yīng)用于關(guān)節(jié)僵硬的實驗動物模型,包括石膏、外固定、克氏針內(nèi)固定或鋼板、螺釘?shù)萚8-11]。我們選擇制動方式以簡單有效為標(biāo)準(zhǔn)。以克氏針交叉固定為基礎(chǔ),考慮到動物的實驗依從性較差,為確保關(guān)節(jié)制動的確實有效,我們另外加上了關(guān)節(jié)外管型石膏加強固定。8周后一并拆除石膏和克氏針解除固定。

既往的膝關(guān)節(jié)僵硬動物模型多數(shù)在解除制動后,關(guān)節(jié)活動度會逐漸恢復(fù),原有的僵硬角度會出現(xiàn)全部或部分丟失[12-14]。因此我們在解除山羊膝關(guān)節(jié)制動后繼續(xù)觀察了 4周并測量重新手術(shù)膝與非手術(shù)膝的僵直角度。我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)膝關(guān)節(jié)并沒有出現(xiàn)明顯的僵直角度丟失。由此我們認(rèn)為,本實驗中的山羊動物模型具有和人類僵直膝關(guān)節(jié)相似的持久性。

3 造模的效果

為檢驗動物模型膝關(guān)節(jié)僵直的程度是否符合本實驗的初始要求,我們采用多種測量方式進行測量比較,分別在術(shù)后 8周測量活體以及術(shù)后 12周分別測量活體和離體的雙膝關(guān)節(jié)僵直程度。實驗結(jié)果表明,無論是在術(shù)后 8周還是在解除制動的術(shù)后 12周,手術(shù)膝均較對側(cè)出現(xiàn)明顯的伸直性膝關(guān)節(jié)僵硬。并且術(shù)后 12周和術(shù)后 8周比較,山羊手術(shù)膝的僵直程度沒有出現(xiàn)明顯的丟失。因此我們認(rèn)為上述膝關(guān)節(jié)僵直動物模型可以實現(xiàn)了實驗的目的,并且該模型具有和人類僵直膝關(guān)節(jié)相似的持久性。在實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后 12周時山羊活體和離體膝關(guān)節(jié)僵直程度存在差別,這種差別可能是由于離體測量標(biāo)本去除了表面皮膚以及人為測量誤差所致。

總之,我們研究的結(jié)果顯示當(dāng)合并骨、膝韌帶破壞和伸直位制動可導(dǎo)致山羊膝關(guān)節(jié)嚴(yán)重和持久的伸直位僵硬。這種山羊膝關(guān)節(jié)僵直模型具有造模簡便、僵直角度不易丟失以及適應(yīng)性廣等特點。因此,該動物模型的建立為未來的藥物和矯形支具干預(yù)提供了更有潛力的實驗對象。

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