脊髓損傷的細(xì)胞療法進(jìn)展

劉明永,趙建華,王愛民

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所骨科,重慶 400042)

脊髓損傷(SCI)發(fā)病率較高,并具有高致殘率、低死亡率的特點(diǎn)。據(jù)美國脊髓損傷信息網(wǎng)統(tǒng)計(jì),美國現(xiàn)有嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙的 SCI患者約 253 000人,并以每年約 11 000人的速度增加,平均發(fā)病年齡為 38歲[1]。SCI嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,并給患者家庭及社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此 SCI一直是基礎(chǔ)及臨床研究的熱點(diǎn)。

脊髓損傷必然導(dǎo)致細(xì)胞死亡。雖然成年脊髓含有內(nèi)源性神經(jīng)干/祖細(xì)胞(NSPCs),但是受到其自身再生能力及局部抑制性微環(huán)境的影響,難以形成有效的細(xì)胞再生,對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用有限。因此,尋找合適的細(xì)胞及策略,替代SCI后死亡的功能細(xì)胞,從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)就成為研究的重點(diǎn)之一。近年來,以干細(xì)胞為代表的細(xì)胞替代研究在SCI領(lǐng)域取得一定進(jìn)展,為 SCI治療帶來曙光。本文就近年來 SCI領(lǐng)域的細(xì)胞療法進(jìn)展做一綜述。

1 干細(xì)胞移植

1.1 人胚胎干細(xì)胞(hESCs) 1998年,Thomson等[2]首先發(fā)現(xiàn) hESCs具有向各種體細(xì)胞分化的多向分化潛能并受到高度關(guān)注。Vadivelu等[3]通過腦的興奮性毒性損傷模型證實(shí),移植的 hESCs可以表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及不同神經(jīng)元亞型的免疫標(biāo)記物,并能夠形成形態(tài)正常的突觸。Nayak等[4]也證實(shí)胚胎干細(xì)胞(hESCs)可以在肌萎縮性側(cè)索硬化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭行纬晒δ苄缘倪\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,為 ESCs在 SCI中的應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

雖然理論上hESCs可以分化為任何一種體細(xì)胞,并可能治愈多種疾病,但是獲取 hESCs需要破壞人類胚胎,由此引起的倫理學(xué)和法律問題始終困撓著 hESCs研究。Klimanskaya等[5]成功地利用桑椹胚期的單個(gè)卵裂細(xì)胞培育出hESCs,在理論上規(guī)避了困擾 hESCs研究的倫理學(xué)問題。但是 hESCs的研究仍面臨諸多問題。首先,hESCs可能誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)。研究顯示,雖然未分化的 hESCs低表達(dá)人白細(xì)胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ),而不表達(dá)人白細(xì)胞抗原-Ⅱ (HLA-Ⅱ),可能能夠逃避宿主的排斥反應(yīng),但是完全分化的 hESCs是否仍能逃避宿主的免疫排斥反應(yīng)尚不得而知。其次,hESCs可能具有潛在致瘤性。hESCs具有癌細(xì)胞的某些特征,如基因不穩(wěn),缺乏自限性,DNA修復(fù)活性增強(qiáng)等,由此導(dǎo)致的潛在的致瘤性限制了 hESCs的應(yīng)用。近來有研究顯示,通過分子生物學(xué)及細(xì)胞篩選技術(shù),能夠在體外通過 hESCs分化、培養(yǎng)成熟膠質(zhì)細(xì)胞,并能夠在 SCI后是損傷軸突再髓鞘化[6]。但是hESCs的潛在致瘤性始終是其研究的局限之一。近來,Yu等[7]通過病毒基因轉(zhuǎn)移,從成年體細(xì)胞逆向分化成功了具有供體免疫學(xué)特征的多能細(xì)胞,該多能細(xì)胞和ESCs相似,具有向多種細(xì)胞分化的潛能。該發(fā)現(xiàn)為規(guī)避ESCs研究的倫理學(xué)限制及免疫匹配提供了可能。但是此種細(xì)胞攜帶有病毒基因,當(dāng)其整合到宿主DNA后是否會(huì)導(dǎo)致突變尚需進(jìn)一步研究。

1.2 胎兒干細(xì)胞 使用胎兒組織移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和帕金森病的報(bào)道最早見 20世紀(jì) 70年代。最近有報(bào)道胎兒來源的神經(jīng)祖細(xì)胞(NPCs)能分化為神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞,在移植后能夠促進(jìn)SCI神經(jīng)功能恢復(fù)[8]。由于來源有限,胎兒干細(xì)胞的研究受到極大限制。

隨著臍血庫的完善,胎兒干細(xì)胞的來源有所增加。先后有學(xué)者使用臍血制備干細(xì)胞,并用于促進(jìn)SCI后軸突的再髓鞘化、增加神經(jīng)營養(yǎng)作用[9]。但是,臍血干細(xì)胞的特性,其促進(jìn) SCI神經(jīng)功能恢復(fù)程度及其機(jī)制仍需大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1.3 成體神經(jīng)干/祖細(xì)胞(aNSPCs) 目前研究發(fā)現(xiàn),在腦和脊髓均存在 aNSPCs。此類細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新和向其來源組織的所有細(xì)胞成分分化的能力。但是實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)此類細(xì)胞在異位移植入其他組織(如脊髓)后存在轉(zhuǎn)分化的可能性。但是 aNSPCs規(guī)避了困擾 ESCs和胎兒干細(xì)胞再生研究的倫理學(xué)和法律問題,所以對(duì)其研究報(bào)道較多。諸多研究證實(shí),aNSPCs可以促進(jìn) SCI后神經(jīng)再生、少突膠質(zhì)細(xì)胞再髓鞘化等病理過程,從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[10]。

近來,Eftekharpour等[11]使用綠色螢光標(biāo)記的 aNSPCs修復(fù)大鼠鉗夾傷 SCI模型取得了一定效果。該實(shí)驗(yàn)中使用的成體 NPCs來源于大鼠腦室下區(qū),培育體系中含 1%的神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)和 99%的成體 NPCs。為了模擬臨床常見的亞急性和慢性 SCI,作者分別于損傷后 2周和 8周移植細(xì)胞。結(jié)果顯示,在亞急性期 NPCs的存活率約 40%,其分布主要局限于脊髓白質(zhì),但是主要分化為膠質(zhì)細(xì)胞,可能和脊髓局部微環(huán)境利于膠質(zhì)細(xì)胞分化有關(guān)。在慢性期移植后成體NPCs很難存活。這可能和脊髓局部抑制性的微環(huán)境及神經(jīng)營養(yǎng)性因素不足有關(guān)[12]。另外,干細(xì)胞移植的數(shù)量、時(shí)機(jī)同樣重要。研究顯示,SCI后第 1周內(nèi),損傷局部免疫反應(yīng)強(qiáng)烈而不利于干細(xì)胞存活,而第 2周移植效果較佳;較為合適的干細(xì)胞數(shù)量為 1×106個(gè)[13]。

1.4 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs) MSCs來源于胚胎中胚層并保持了干細(xì)胞核心的自我更新和向不同結(jié)締組織細(xì)胞分化的多向分化潛能。MSCs已被用于 SCI模型的實(shí)驗(yàn)研究,但是MSCs能否分化為神經(jīng)細(xì)胞仍存在爭論。Phinney等[14]綜述發(fā)現(xiàn)有研究證實(shí) MSCs在體內(nèi)能夠表達(dá)巢蛋白(nestin)和成纖維細(xì)胞酸性蛋白(GFAP),并在特定的培養(yǎng)環(huán)境中呈神經(jīng)元樣的形態(tài),從而認(rèn)為MSCs能夠轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)細(xì)胞。然而,nestin和GFAP并非是神經(jīng)組織所特有的標(biāo)記物,在中胚層來源的其他組織,如肌肉和軟骨組織中也有表達(dá)。而形態(tài)的相似可能是源于特定培養(yǎng)基的假陽性,而不能得到神經(jīng)元特定的功能檢測(cè),如神經(jīng)電生理學(xué)的支持,所以MSCs是否能夠轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)細(xì)胞尚需進(jìn)一步研究,而 MSCs移植促進(jìn) CNS損傷功能恢復(fù)可能是源于其分泌生長因子或調(diào)控局部免疫反應(yīng)的能力。Lu等[15]使用攜帶神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的骨髓來源 MSCs移植于慢性SCI大鼠,發(fā)現(xiàn)MSCs可以促進(jìn)軸突再生并通過膠質(zhì)瘢痕,但是實(shí)驗(yàn)未觀察到神經(jīng)功能恢復(fù),顯示再生的軸突未能和宿主組織形成有效的突觸聯(lián)系;還有研究顯示,MSCs促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用可能來自于神經(jīng)保護(hù)途徑,如抑制Fas介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

2 雪旺細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞(OECs)

雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的構(gòu)成細(xì)胞,在采用再髓鞘化策略治療 CNS疾病時(shí)常作為替代細(xì)胞。由于雪旺細(xì)胞易于臨床制備,雖然存在導(dǎo)致神經(jīng)鞘炎的風(fēng)險(xiǎn)(和硫酸軟骨素蛋白多糖形成增加有關(guān)),并可能加重神經(jīng)痛的發(fā)生,但是研究內(nèi)源性 OECs在SCI局部的浸潤、分布及對(duì)髓鞘形成的影響的文章仍較多。

在周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,雪旺細(xì)胞通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)成分為軸突再生提供良性環(huán)境,并最終實(shí)現(xiàn)軸突的再髓鞘化。有研究顯示,移植雪旺細(xì)胞至 SCI局部后,雪旺細(xì)胞能夠和宿主組織整合,實(shí)現(xiàn)感覺神經(jīng)軸突的再生和軸突的髓鞘化,并促進(jìn)動(dòng)物后肢功能的輕度改善。研究也發(fā)現(xiàn),雖然內(nèi)源性雪旺細(xì)胞能夠存在于脊髓空洞內(nèi),但是存活率很低[16];而來源于皮膚的雪旺細(xì)胞雖然可以在脊髓空洞內(nèi)存活,誘導(dǎo)軸突再生和髓鞘化,但是這些軸突的分布規(guī)律及其功能尚需進(jìn)一步研究。OECs表型特征和雪旺細(xì)胞相近,聯(lián)合移植能夠強(qiáng)化雪旺細(xì)胞的治療作用。有學(xué)者認(rèn)為OECs不僅和軸突再生有關(guān),而且和 SCI后再髓鞘化或脫髓鞘疾病有關(guān),相反的結(jié)論也有報(bào)道[16]。出現(xiàn)矛盾性結(jié)果的原因可能和供體年齡及細(xì)胞分離的方法不同有關(guān)。OECs和雪旺細(xì)胞均表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)素受體(p75),而后者經(jīng)常用于OECs的純化,所以雪旺細(xì)胞對(duì) OECs的沾染或許能部分解釋所觀察到的 OECs在軸突髓鞘化方面的矛盾性結(jié)果,而電鏡觀察也證實(shí) OECs是軸突再生的主要支持細(xì)胞,為內(nèi)源性雪旺細(xì)胞形成髓鞘提供結(jié)構(gòu)性骨架。

3 免疫細(xì)胞

傳統(tǒng)的理論認(rèn)為,免疫反應(yīng)導(dǎo)致SCI的繼發(fā)性損傷,CNS有害或者參與繼發(fā)性損傷。但是,越來越多的證據(jù)顯示,適度的免疫反應(yīng)為SCI治療所必須,并具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。1990年,David等[17]研究發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可以促進(jìn)軸突的再生,部分逆轉(zhuǎn)哺乳動(dòng)物CNS損傷的不可逆狀態(tài)。而研究亦證實(shí),SCI后的保護(hù)性免疫反應(yīng)主要是由 T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫[18]。Schwart等[19]進(jìn)一步研究證實(shí),導(dǎo)致自身免疫性疾病、具有神經(jīng)保護(hù)作用的為 Th-1細(xì)胞(T helper 1 cell)。Yoles等[20]的研究證實(shí)CNS損傷后,自然發(fā)生的 CD 4+CD 25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Treg)抑制了保護(hù)性 T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。而通過過度表達(dá)髓磷脂堿性蛋白(MBP)反應(yīng)性 T細(xì)胞受體的轉(zhuǎn)基因小鼠的研究,顯示在視神經(jīng)損傷(ONI)小鼠,視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率較野生型小鼠高。而 Jones等[21]利用相同的轉(zhuǎn)基因小鼠所做的研究卻顯示出相反的結(jié)果。在該實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)基因小鼠中＞95%的 CD4+T細(xì)胞為針對(duì) MBP的 T細(xì)胞。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因小鼠的后肢負(fù)重能力明顯弱于野生型小鼠,而軸突脫髓鞘、損傷范圍亦重于野生型小鼠。實(shí)驗(yàn)還證實(shí),SCI后,轉(zhuǎn)基因小鼠的周圍淋巴組織的細(xì)胞因子增加以 Th-1細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)為主,而分泌 IL-4、IL-5的Th-2細(xì)胞亦增加;而 IL-10的分泌卻減少。后者是一種 SCI的潛在性保護(hù)因子。上述實(shí)驗(yàn)的矛盾性結(jié)果,顯示了 SCI后免疫反應(yīng)的復(fù)雜性。表明局部免疫必須處于嚴(yán)格的調(diào)控之下,才能對(duì)SCI起到治療作用。

由于 Th1、Th2、Treg等功能性淋巴細(xì)胞的活化、分化均與樹突狀細(xì)胞(DCs)的調(diào)控有關(guān),故 DCs在 SCI中的作用近來逐漸受到重視。DCs是專職抗原呈遞細(xì)胞,在SCI的免疫反應(yīng)中起到重要的調(diào)控作用。Schwartz等[22]所在的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn) DCs移植后可增加神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)、IL-2等保護(hù)性細(xì)胞因子的表達(dá),促進(jìn)損傷的 SCI功能恢復(fù),將其用于臨床實(shí)驗(yàn),取得較好的效果,由此提示DCs調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)在 SCI修復(fù)中具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。Hauben等[23]證實(shí):在大鼠 SCI后,通過損傷局部或給予負(fù)載髓鞘堿性蛋白的樹突細(xì)胞(mbpDCs),均可顯著促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù),改善神經(jīng)組織病理狀態(tài),而較單純 DCs效果更佳。Mikam i等[24]證實(shí):DCs在體外可以增加 NSPCs的存活和分化;在共同移植后,能夠活化內(nèi)源性 NSPCs啟動(dòng)神經(jīng)再生,并分泌NT-3,活化小膠質(zhì)細(xì)胞,從而促進(jìn)小鼠 SCI功能恢復(fù)。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)使用負(fù)載脊髓勻漿蛋白的樹突狀細(xì)胞(hp-DCs)修復(fù) BALB/c品系(BALB/c)小鼠脊髓損傷,實(shí)驗(yàn)觀察84天,結(jié)果顯示hpDCs可以顯著促進(jìn)小鼠脊髓損傷神經(jīng)功能恢復(fù),增加體內(nèi)nestin表達(dá),降低 GFAP表達(dá),降低斑痕厚度,縮小脊髓空洞。上述研究均證實(shí)免疫細(xì)胞在SCI的修復(fù)中起到重要作用。

4 結(jié)論

以干細(xì)胞、免疫細(xì)胞為代表的細(xì)胞移植治療SCI取得了一定進(jìn)展,其中,神經(jīng)干細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞,修補(bǔ)組織缺損,提供營養(yǎng)支持,并可能在良好調(diào)控的條件下構(gòu)建新的突觸聯(lián)系。因此,干細(xì)胞療法或可為脊髓損傷的治療帶來曙光并可能取得突破。目前細(xì)胞療法治療 SCI的主要目標(biāo)是:(1)促進(jìn)神經(jīng)元再生;(2)促進(jìn)再髓鞘化;(3)提供營養(yǎng)分子促進(jìn)細(xì)胞保護(hù);(4)調(diào)控局部免疫反應(yīng)。其終極目標(biāo)是增加內(nèi)源性 NSCs的潛能。但是損傷后活化的內(nèi)源性成體NPCs作用有限,難以有效彌補(bǔ)損傷的細(xì)胞,最終的解決之道可能在于采用多種聯(lián)合的治療策略,包括減少膠質(zhì)瘢痕、清除抑制分子、免疫調(diào)控及組織工程支架橋接損傷區(qū)等。而如何在損傷脊髓組織營造一種有利于干細(xì)胞存活并向神經(jīng)元分化的微環(huán)境,如何調(diào)控免疫干預(yù)的時(shí)效性可能是未來研究的主要方向。

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