丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠腦缺血再灌注過氧化損傷的保護(hù)作用

【摘要】 目的 觀察丹參多酚酸鹽對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織內(nèi)SOD、GSHPx和MDA含量的影響，探討其缺血腦保護(hù)的作用機(jī)制。

方法線栓法制作大鼠中動(dòng)脈缺血再灌注損傷模型。SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺血再灌注組、丹參多酚酸鹽低劑量治療組（10 mg/kg）和丹參多酚酸鹽高劑量治療組（30 mg/kg）。各組動(dòng)物按要求給藥，在預(yù)定時(shí)間進(jìn)行神經(jīng)損傷行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積及腦組織內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性和丙二醛（MDA）含量的測定。結(jié)果 與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸鹽治療組大鼠神經(jīng)損傷行為學(xué)評(píng)分及腦梗死體積減少，腦組織內(nèi)SOD、GSHPx活性升高，MDA含量下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且呈劑量依賴性。結(jié)論丹參多酚酸鹽可通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)抗氧化酶的活性，從而介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 丹參多酚酸鹽；腦缺血再灌注；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶；丙二醛

文章編號(hào)：1003-1383(2010)06-0665-03 中圖分類號(hào)：R 743文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.06.005

The effect of salvianolate on the peroxidation injury induced by focal

cerebral ischemia reperfusion in rats

WANG Qiang1，ZHANG Yi1，LI Lu2，DONG Bo1，YANG Yilin1

(1.Department of Neurosurgery，2.Department of Clinical Laboratory，

Changzhou First People's Hospital，Changzhou 213003，China)

【Abstract】 ObjectiveTo study the protective effect of salvianolate on the peroxidation injury induced by focal cerebral ischemia reperfusion in rats and to reveal the mechanism.

Methods 48 SD rats were divided into four group randomly，they are normal control group，ischemia reperfusion group，salvianolate (10 mg/kg) group and salvianolate(30 mg/kg)group.Each group contained 12 rats.The Longa method was used to establish the MCAO model.The salvianolate at different dose were injected intraperitoneally at different time point according to the test design. The brain infarct volume by TTC stain and behavior scores by Bederson's methods were also determined in order to evaluated the protective effect.Also we use assay kit to determine the activities of SOD and GSHPx，content of MDA in each group.

Results Comparing with the ischemia reperfusion group， brain infarct volume and behavior score of salvianolate group was lower，the activities of SOD and GSHPx of brain tissue increased，the content of MDA decreased.There was significant difference between them(P＜0.05)，the effect of salvianolate was dosedependent.

Conclusion The salvianolate plays neuroprotective effect by inhibiting the lipid peroxidation and protect the activity of antioxidant enzyme.

【Key words】salvianolate；cerebral ischemia reperfusion；SOD；GSHPx；MDA

大量證據(jù)表明氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。缺血再灌注可使自由基連鎖反應(yīng)激化，大量的自由基引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能損害。丹參是一種傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，在臨床上被廣泛用于治療冠心病、心絞痛、缺血性中風(fēng)等疾病，丹參多酚酸是其最重要的有效成分［1］。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹參多酚酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血具有顯著的保護(hù)作用［2］，但其機(jī)制尚不明確。本研究在建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型基礎(chǔ)上，觀察再灌注后大鼠神經(jīng)功能、腦梗死體積及缺血腦組織內(nèi)SOD、GSHPx和MDA的變化，探討丹參多酚酸鹽對(duì)局灶性腦缺血再灌注的保護(hù)作用及其機(jī)制。

材料和方法

1.動(dòng)物及試劑 SD大鼠購自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。注射用丹參多酚酸鹽（中國上海綠谷藥業(yè)，批號(hào)20070101），SOD、GSHPx、MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，氯化三苯基四氮唑（TTC）購自北京化學(xué)試劑公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.動(dòng)物分組及模型制作 成年雄性SD大鼠48只，體重230～250 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺血再灌注組、丹參多酚酸鹽低劑量組（10 mg/kg）及丹參多酚酸鹽高劑量組（30 mg/kg），每組12只。參照Longa［3］法，制作大鼠MCAO模型。大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（45 mg/kg），頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。結(jié)扎CCA近心端、ECA起始端后，翼腭動(dòng)脈短暫夾閉以防誤插，經(jīng)CCA插入線栓（線栓為直徑0.23 mm進(jìn)口魚線，頭端涂抹石蠟［4］），插入深度由分叉部記(18.0±0.5)mm。再灌注處理為拉線栓使線頭退至頸外動(dòng)脈。術(shù)中維持肛溫(37±0.5)℃；缺血時(shí)間2 h，再灌注72 h。在缺血期間及再灌注后2 h保持體溫在（37±0.5）℃。丹參低劑量組及高劑量治療組在術(shù)后60 min、術(shù)后第1 d及第2 d，分別將10 mg/kg及30 mg/kg的丹參多酚酸鹽溶于生理鹽水中，腹腔注射；正常對(duì)照組和缺血再灌注組腹腔注射等量的生理鹽水。模型成功的標(biāo)志為大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓，站立不穩(wěn)，提尾時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈。

3.神經(jīng)功能缺損評(píng)分 各組動(dòng)物于蘇醒后6 h內(nèi)按照Zea Longa和Bederson的方法進(jìn)行評(píng)分，0分：無神經(jīng)缺損癥狀；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3分：向右側(cè)傾倒；4分：不能自己行走或昏迷。評(píng)分為0分、有呼吸困難、提前死亡及處死后發(fā)現(xiàn)有蛛網(wǎng)膜下腔出血的均棄之不用，手術(shù)中出血過多的大鼠亦予以剔除，并均在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)足。建模成功大鼠缺血后24 h再次評(píng)分，將此分?jǐn)?shù)錄入實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4.腦梗死體積的測定 每組隨機(jī)選擇6只大鼠，適時(shí)斷頭取腦，棄去嗅球、小腦及低位腦干。置-20℃冰箱中冷凍20 min，距額極3 mm開始切片，每片厚2 mm，放入1％TTC水溶液中，37℃孵育30 min。缺血區(qū)染成白色，有正常血供的腦組織為紅色。染色后以10%甲醛溶液避光保存24小時(shí)，數(shù)碼相機(jī)拍照后，應(yīng)用病理圖像分析儀測定梗死面積，根據(jù)公式V=（A1+…+An）t/2算出梗死體積，其中t為切片厚度，A為梗死面積。

5.指標(biāo)測定 大鼠戊巴比妥鈉麻醉后斷頭處死，冰盤上快速取左側(cè)額頂葉背外側(cè)區(qū)皮質(zhì)，精確稱重后用預(yù)冷的勻漿介質(zhì)制成10％腦勻漿。低溫高速離心15 min，取上清-70℃冰箱保存。嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行SOD、GSHPx活性及MDA含量測定。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-±s)表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包，以單因素方差分析和t檢驗(yàn)作差異的顯著性分析。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.行為學(xué)評(píng)分 與缺血再灌注組比較，丹參多酚酸鹽可以明顯降低實(shí)驗(yàn)大鼠的行為學(xué)評(píng)分，且高劑量組降低程度較低劑量組更為顯著(P＜0.05）。見表1。

2.腦梗死體積 與缺血再灌注組比較，丹參多酚酸鹽可以明顯減少實(shí)驗(yàn)大鼠的腦梗死體積，且高劑量組較低劑量組更為顯著 (P＜0.05)。見表1。

3.丹參多酚酸鹽對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織SOD、GSHPx和MDA的影響缺血再灌注后腦組織內(nèi)SOD及GSHPx活性降低，MDA含量明顯升高；丹參多酚酸鹽可提高SOD及GSHPx活性，降低MDA含量，且高劑量組與低劑量組間有顯著性差異 (P＜0.05)。見表2。

討論

缺血性腦血管病是臨床常見的致死性疾病之一，對(duì)人類健康危害極大。腦缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，再灌注期產(chǎn)生的大量自由基導(dǎo)致的過氧化反應(yīng)已被證實(shí)參與了腦損傷的發(fā)生。自由基是帶有不成對(duì)自由電子的化學(xué)基團(tuán)，性質(zhì)異?；钴S，易與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生一系列過氧化反應(yīng)。其既可通過損傷大分子物質(zhì)導(dǎo)致缺血性腦損傷，也能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑損傷腦組織。SOD和GSHPx是細(xì)胞內(nèi)兩種主要的抗氧化酶，可增加自由基的清除，它們是體內(nèi)自由基平衡的酶性調(diào)節(jié)劑，可調(diào)動(dòng)或激活機(jī)體中的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，有利于預(yù)防或減輕自由基損傷，也是較敏感并能反映細(xì)胞抗氧化能力的觀察指標(biāo)。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用而形成的脂質(zhì)過氧化物，它的量反映了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷程度。

研究證實(shí)，減少自由基的產(chǎn)生或增強(qiáng)清除自由基的能力，能產(chǎn)生腦保護(hù)作用［5］。本研究顯示丹參多酚酸鹽使SOD和GSHPx活性的下降趨勢得到了明顯改善，腦組織中SOD和GSHPx的活性增加，同時(shí)MDA的含量也明顯降低。說明丹參多酚酸鹽能改善機(jī)體氧自由基生成與清除之間的動(dòng)態(tài)平衡，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，一方面增強(qiáng)了腦組織清除氧自由基的能力，同時(shí)也能減輕MDA引起的損傷，這是其發(fā)揮缺血腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。

丹參多酚酸鹽能提升組織中SOD 和GSHPx的活性的具體機(jī)制尚不清楚，但可能與其能清除體內(nèi)自由基有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)靜脈應(yīng)用丹參后，左半結(jié)腸癌切除術(shù)后患者血中SOD活性明顯上升，同時(shí)自由基含量也明顯減少［6］。王舒平等［7］證實(shí)了丹酚酸能清除實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)自由基。自由基被清除后，SOD和GSHPx的消耗大大減低，從而間接提高了SOD和GSHPx的活性，增強(qiáng)了腦組織抗自由基損傷的能力，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

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(收稿日期：2010-09-08 修回日期：2010-12-03)

(編輯：潘明志：英文審校：鐘京梓)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文