妥舒沙星人體血藥濃度測定及藥代動力學研究

【摘要】 目的 建立反相高效液相色譜熒光檢測法測定人血漿中妥舒沙星濃度的方法。方法以加替沙星為內標，血漿經酸化采用20%高氯酸提取，色譜柱為XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈甲醇20 mmol#8226;L-1磷酸二氫鉀（15∶15∶70），熒光檢測(λex=342 nm，λem=420 nm)。結果 妥舒沙星血漿濃度在10.80~1296 ng#8226;ml-1內具有良好線性關系，平均相對回收率大于95%，萃取回收率大于60%，日內、日間相對標準差（RSD）均小于4.3%。結論該方法靈敏、準確，可用于妥舒沙星的藥動學研究。

【關鍵詞】 高效液相色譜熒光法；妥舒沙星；血漿

文章編號：1003-1383(2010)06-0675-04 中圖分類號：R 927.2 文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.06.010

Determination of tosufloxacin in human plasma by reversedphase highperformance

liquid chromatographic fluorometry

HUANGShiqian

（Medical School Affiliated Hospital of Guangxi Guidong， Wuzhou 543100）

【Abstract】 ObjectiveA sensitive liquid chromatographic fluorometry was developed for the determination of the active metabolite of tosufloxacin.

Methods Gatifloxacin was used as the internal standard.After adding 20% perchloric acids to plasma samples， precipitating and centrifugating，plasma samples were separated on a XDB C18 column (150×4.6mm，5μm)， with the mobile phase consisted of acetonitrilemethanol20 mmol#8226;L-1 KH2PO4 (15∶15∶70，v∶v∶v) .The fluorescence detection wave length was λex=342 nm，λem=420 nm.

Results The calibration curves was linear over the concentration ranged of 10.80 to 1296ng#8226;ml-1(r=0.9987)，The average relative recovery was 95.62%~107.7%，RSD was 1.4%~2.5%. The extraction recovery was 2.3%~6.4%.Intraand interday precision ranged from 1.4 to 2.5 and 2.8 to 4.3%respectively.

Conclusion The method was sensitive，rapid and accurate and could be used in the monitoring of therapeutic drugs and human pharmocokinetic study of tosufloxacin.

【Key words】HPLC;tosufloxacin;plasma

妥舒沙星屬于第4代喹諾酮類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強的特點，尤其對需氧革蘭陽性球菌和厭氧菌的作用較強。目前在臨床上妥舒沙星主要用于治療呼吸道、膽道、皮膚軟組織、耳鼻喉和口腔等感染［1］但有關妥舒沙星血藥濃度測定的報道較少［2，3］，且普遍存在測定靈敏度低、最低定量下限較高的弊端。筆者建立高效液相色譜熒光法測定健康人血漿中妥舒沙星的藥物濃度分析方法，發現該方法操作簡單、快速、靈敏度高，結果準確，可用于妥舒沙星人體血藥濃度測定及藥動學研究。

材料與方法

1.藥品與儀器①儀器：Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent)；AG285分析天平（瑞士Mettler Toledo公司)；MS1 Minishaker 渦旋振蕩儀(廣州科儀實驗室技術有限公司)；Biofuge stratos 高速冷凍離心機(德國heraeus)。②藥品與試劑:妥舒沙星對照品(赤峰萬澤制藥有限責任公司，批號:20070504)；加替沙星(內標，中國藥品生物制品檢定所)。試劑：甲醇、乙睛為色譜純，水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2.方法

（1）色譜條件 色譜柱為XDB C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為乙腈:甲醇:20 mmol#8226;L-1KH2PO4=15∶15∶70；流速為1.0 ml#8226;min-1；柱溫30℃；檢測波長為：λex=342 nm，λem=420 nm。

（2）對照品與內標儲備液的配制 精密稱取妥舒沙星標準品10.8 mg于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，再取1 ml該溶液于100ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得濃度為10.8 g#8226;ml-1的儲備液，于4℃冰箱保存。

精密稱取加替沙星標準品16.0 mg于100 ml容量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，得濃度為160.0g#8226;ml-1的內標物儲備液，于4℃冰箱保存［4］。

（3）血漿樣品前處理 取0.2 ml肝素抗凝血漿樣品置1.5 ml離心管中，加入32g#8226;ml-1內標加替沙星10L，1 mol#8226;L-1鹽酸20 L，甲醇100L，混勻，加入20L 20%高氯酸，12000 r#8226;min-1高速離心15 min，取出上清液，進樣40L。

結果

1.方法的專屬性 圖1~3中分別為空白血樣、空白血樣中加入對照品、服藥后血樣色譜圖。妥舒沙星保留時間約為7.5 min，內標加替沙星保留時間約為4 min，血漿內源性物質及其它雜質不干擾樣品和內標的測定。

2.線性范圍及最低定量下限 分別精密吸取妥舒沙星標準儲備液適量，用空白血漿稀釋成不同濃度（10.80 ng#8226;ml-1、32.40 ng#8226;ml-1、108.0 ng#8226;ml-1、324.0 ng#8226;ml-1、648.0 ng#8226;ml-1、1296 ng#8226;ml-1）的標準液，按樣品處理方法處理，妥舒沙星與內標峰面積之比（Y）與妥舒沙星濃度（X）進行加權線性回歸，得直線回歸方程Y=0.001X－0.0219，線性系數為r=0.9997（見圖4），妥舒沙星濃度在10.80 ng#8226;ml-1~129 ng#8226;ml-1范圍內線性關系良好，該方法血漿中妥舒沙星最低定量下限為10.80 ng#8226;ml-1。

3.精密度及回收率 配制濃度為低、中、高（32.40 ng#8226;ml-1、324.0 ng#8226;ml-1、1296 ng#8226;ml-1）的妥舒沙星標準血漿各5份，按樣品處理方法平行操作，得日內相對標準差（RSD）分別為 2.5%、2.4%和1.4%，平均相對回收率分別為107.7%、95.6%和107.3%（表1）；連續測定3天，得日間相對標準差（RSD）分別為 4.3%、2.8%和2.8%（表2）。

4.萃取回收率 配制濃度為低、中、高（ 32.40 ng#8226;ml-1、324.0 ng#8226;ml-1和1296 ng#8226;ml-1） 的妥舒沙星標準血漿各5份，按樣品處理方法處理進樣，另用流動相配制相應濃度妥舒沙星溶液，不經處理直接進等量樣品，以此為標準，兩組峰面積之比值得妥舒沙星的萃取回收率分別為61.7%、90.2%和86.2%，內標加替沙星經同法處理得相應萃取回收率為93.3%。見表3。

5.穩定性考察

（1）血樣的室溫穩定性 配制低、中、高（32.4 ng#8226;ml-1、324 ng#8226;ml-1和1296 ng#8226;ml-1）的妥舒沙星標準血漿樣品，室溫放置，分別在0 h、4 h、8 h、12 h按樣品處理方法處理進樣，記錄對照品及內標的峰面積。結果濃度的RSD為4.0％、8.5%、1.6%（表4），結果表明低、中、高（32.40 ng#8226;ml-1、324.0 ng#8226;ml-1和1296 ng#8226;ml-1）妥舒沙星血樣在室溫下12 h內穩定。

（2）血樣的凍融穩定性 配制低、中、高（32.40 ng#8226;ml-1、324.0 ng#8226;ml-1和1296 ng#8226;ml-1）的妥舒沙星標準樣品，置-2℃ 冰箱冷凍，取出樣品室溫融解，然后再冷凍，反復3次，每次按樣品處理方法處理，記錄對照品及內標的峰面積。結果濃度的RSD為3.3％、7.0%、0.95%（見表5），結果表明低、中、高（32.4 ng#8226;ml-1、324 ng#8226;ml-1和1296 ng#8226;ml-1）妥舒沙星歷經3次凍融后穩定。

6.人體藥代動力學實驗選擇20名男性健康志愿受試者，年齡19～26歲，體重57～78 kg，身高166～183 cm，常規體檢及生化檢驗結果證明肝腎功能正常，心電圖正常，生活習慣良好，無異常既往病史。試驗經倫理委員會批準，受試者試驗前均簽署知情同意書。受試者隨機交叉服用試驗制劑（甲苯磺酸妥舒沙星分散片，0.15 g/片，批號：20070708）和參比制劑（甲苯磺酸妥舒沙星片，0.15 g/片，批號：20070504）。受試者進清淡晚餐后禁食過夜（至少10小時），于晨起空腹服藥［單次服用2片受試制劑（T）或2片參比制劑（R），用量0.3 g］第一周期試驗于給藥24 h后結束，經過7天洗脫時間后開始下一周期試驗，方法同第一周期試驗。服藥前（0 h）及服藥后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h分別從肘靜脈取血4 ml，肝素抗凝，分離血漿至-20 ℃保存。兩制劑主要藥動學參數見表6；血藥濃度時間曲線見圖4。

討論

在血漿樣品處理過程中，筆者比較了20%高氯酸、三氯乙酸和乙酸乙酯三種提取溶劑，發現采用20%高氯酸提取的血樣色譜行為干凈，無內源性雜質干擾，且血樣中妥舒沙星的提取比例要高于三氯乙酸、乙酸乙酯。而比較提取后用40℃氮氣吹干，流動相溶解進樣與提取離心后直接進樣的方法發現，后者提取效率更高。妥舒沙星為弱酸性化合物，在酸性環境中其主要以分子形式存在，有助于提高有機溶劑萃取率，實驗中筆者比較了磷酸、1 mol#8226;L-1鹽酸兩種酸化方式，發現以1 mol#8226;L-1鹽酸酸化效果最好，樣品雜質少、提取率高。

在內標的選擇上，實驗前考察了培氟沙星、帕珠沙星、加替沙星等化合物［5，6］。在本文色譜條件下，培氟沙星和帕珠沙星的保留時間與妥舒沙星相差太遠；且帕珠沙星的色譜行為較差，最終發現加替沙星色譜行為好，保留時間與妥舒沙星比較接近，且在樣品提取條件下，萃取回收率高，故選擇加替沙星為內標。

有文獻［2］報道流動相選用甲醇乙腈0.05%H3PO4（pH=4.0），但酸性越低，妥舒沙星色譜峰形差、易脫尾，經實驗摸索采用20 mmol#8226;L-1KH2PO4作為水相，確定流動相為甲醇乙腈20 mmol#8226;L-1KH2PO4（15∶15∶70）（醋酸調pH至6.0），妥舒沙星峰和內標峰分離完全，峰型好，不受內源性雜質峰干擾，妥舒沙星和加替沙星色譜峰也比較穩定，故選擇此混合溶液為流動相。

高效液相色譜熒光法靈敏度高，干擾因素多［7］。人血清中某些氨基酸及其代謝產物本身具有熒光，可能會干擾妥舒沙星的測定，因此采用適宜的提取方法顯得尤為重要。本實驗采用經酸化采用20%高氯酸提〗取的方法簡便易行，回收率高，收干擾因素少，符合實驗要求。

本實驗采用高效液相色譜熒光法測定血漿中妥舒沙星濃度的方法，具有較高的靈敏度和選擇性，是體內藥物分析常用的分析方法之一，能夠滿足本試驗低濃度藥物測定以及藥物動力學研究的要求。

參考文獻

［1］劉明亮.喹諾酮類抗菌藥的概況與展望［J］.國外醫藥抗生素分冊，2001，22（1）:1-4.

［2］李 勇，袁 洪，譚鴻毅，等.高效液相色譜法測定人體內血漿中的妥舒沙星［J］.南華大學學報，2007，35（1）:104-106.

［3］陳 悅，駱曉斌.高效液相色譜法測定甲苯磺酸妥舒沙星的含量［J］.西北藥學雜志，1999，14（2）: 51-52.

［4］潘龍華，李小剛.高效液相色譜法測定加替沙星的血藥濃度［J］.時珍國醫國藥，2007， 5(2):408.

［5］Appelbaum PC，Hunter PA.The fluoroquinolone antibacterial:past，present，andperspectives［J］. Int J Antimicrob Agents，2000，16(1):5-15.

［6］S Diane Goodwin，et al.Pharmacokinetics and safety of levofloxacin in patients with human immunodeficiency virus infection［J］.Antimicrob Agents Chemother，1994，38(4):799-804.

［7］Nobuki Aoki，Usuda Y，koda Y，et al.Clinical pharmacology and efficacy of levofloxacin in elderly patients［J］.Jap J Antibiot，1992，45(5):530-538.

(收稿日期：2010-08-23 修回日期：2010-11-11)

(編輯：梁明佩 英文審校：鐘京梓)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內容請以PDF格式閱讀原文