三氧化二砷誘導SGC7901細胞凋亡及對bcl-2\\cyclin D1表達的影響

[摘要]目的 了解三氧化二砷對胃腺癌SGC7901細胞株細胞增殖、細胞凋亡以及bcl-2、cyclin D1基因表達的影響。方法 分別以不同濃度的三氧化二砷作用于SGC7901細胞，作用不同時間后采用MTT檢測法對細胞增殖活性進行檢測;采用流式細胞儀(FCM)AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡率;逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測bcl-2、cyclinD1基因轉錄水平。結果 稍高濃度(≥2μmol/L)的三氧化二砷可抑制SGC7901細胞增殖，并有劑量和時間依賴性。逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測bcl-2、cyclin D1基因轉錄水平，發現三氧化二砷作用組bcl-2、cyclin D1基因的表達與對照組比較明顯減低(P<0.01)。結論 三氧化二砷可有效抑制SGC7901細胞增殖，誘導SGC7901細胞凋亡，與作用劑量和作用時間呈正相關，這一過程可能與三氧化二砷抑制bcl-2、cyclin D1表達有關。

[關鍵詞] 胃腺癌;三氧化二砷;細胞凋亡;bcl-2;cyclin D1

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)04-32-03

Arsenic Trioxide-induced SGC7901 Cell Apoptosis and Its Effect on Gene Expression of bcl-2 and cyclin D1

HUANG DefengZHAO ZhiguoMA JunCUI Yi

Department of Gastroenterology，the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450014，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of arsenic trioxide on gastric adenocarcinoma cell line SGC7901 cell proliferation，apoptosis，and bcl-2，cyclin D1 gene expression. Methods SGC7901 cells were treated with different concentrations of arsenic trioxide at different time and after that，the proliferation of SGC7901 cells，the apoptosis rate and the gene transcription level of bcl-2 and cyclin D1 were detected by MTT，by flow cytometry and AnnexinV/PI double staining and by RT-PCR，respectively. Results Slightly high concentration of arsenic trioxide(≥2μmol/L) could inhibit cell proliferation and induce SGC-7901 apoptosis， with a dose-and time -dependency. The bcl-2 and cyclin D1 gene expression was obviously lowered in the arsenic trioxide group than that of the control(P<0.01). Conclusion Arsenic trioxide can effectively inhibit cell proliferation and induce SGC7901 apoptosis，with a direct relation to the dose and time，which may be correlated with the inhibition of bcl-2 and cyclin D1 expression by arsenic trioxide.

[Key words] Gastric adenocarcinoma;Arsenic trioxide;Apoptosis;bcl-2;cyclin D1

三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)是中藥砒霜的主要有效成分，近年來研究表明，三氧化二砷除了能治療血液系統疾病，對包括胃癌在內的多種惡性實體瘤也有強大的殺傷作用。胃癌是我國常見的惡性腫瘤，其對放、化療的敏感性均較低，死亡率高，晚期尚缺乏有效的治療手段，尋找新的治療藥物和治療手段乃當務之急。

誘導胃癌細胞凋亡是治療的新思路。三氧化二砷可以誘導惡性腫瘤細胞凋亡進而抑制腫瘤生長發揮治療作用，分子機制涉及多個凋亡調控分子[1]。周期素D1(cyclin D1)能激活CDK2、4、5，促進細胞由G1期進入S期，進行DNA合成，使細胞持續性增殖[2]。bcl-2是從濾泡性淋巴瘤中分離出的一種癌基因，也是細胞凋亡抑制因子，具有抑制細胞凋亡、延長細胞壽命的功能[3]。本研究應用三氧化二砷作用于胃腺癌SGC7901細胞，觀察三氧化二砷對SGC7901細胞凋亡的影響，以及此過程中bcl-2、cyclin D1基因表達的變化，探討三氧化二砷誘導胃腺癌SGC7901細胞凋亡的機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器 CO2培養箱(美國Thermo)、溫度梯度PCR儀(美國Bio-Rad)、普通及倒置顯微鏡(日本Olympus)、臺式低速及高速冷凍離心機(德國Eppendorf)、96孔培養板及25cm培養瓶(美國Corning)、FACScan型流式細胞儀(美國Becton Dickinson)、普通及超低溫冰箱、高壓滅菌鍋、電熱恒溫干燥箱、微量移液器等。

1.1.2試劑 三氧化二砷購自哈爾濱醫科大學藥業有限公司，PBS配制成50μmol/L貯存液，4℃保存。RPMI-1640培養基為Gibco公司產品，胎牛血清購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司，青霉素、鏈霉素、MTT為Amresco公司產品，MTT使用前用PBS稀釋為5mg/mL，200目微孔濾膜過濾除菌，4℃避光保存。AnnexinV-F ITC細胞凋亡檢測試劑盒為ACT Gene公司產品。Trizol、MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR擴增試劑盒、DNA marker、引物合成均來自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3細胞株與細胞培養胃腺癌SGC-7901細胞株由本實驗室傳代培養，RPMI-1640培養基，含10%胎牛血清，青、鏈霉素各100 U /mL，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代。細胞解凍復蘇后傳代2 ~ 3次進入對數生長期。

1.2實驗方法

1.2.1細胞增殖及細胞增殖抑制實驗采用MTT檢測法。取對數生長期SGC-7901細胞，以(5×104)個/mL接種于96孔平底板，每孔接種200μL。37℃、5%CO2、飽和濕度下培養箱培養24h細胞貼壁后，實驗組在培養基中加入不同濃度的三氧化二砷，終濃度分別為1、2、4、8、16μmol/L。每組設五個復孔。對照組不加藥。另設含有藥物的培養液作為本底對照組。分別培養24、48、72h(48h換液一次)后取出，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，繼續培養4h，吸棄孔內上清，每孔加入DMSO 150μL，37℃空氣浴振蕩器中水平振蕩10min至結晶完全溶解，酶標儀上測定各孔A490nm值，記錄結果。生長抑制率=(對照組A490nm-實驗組A490nm)/對照組A490nm×100%，并以生長抑制率為縱坐標，作用時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。

1.2.2Annexin V/PI雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡率采用流式細胞儀(FCM)Annexin V/PI雙染法檢測:取對數生長期細胞，以(1×106)個/孔的密度種植于25cm培養瓶，培養48h細胞貼壁后，加三氧化二砷至不同終濃度，孵育48h后收集所有懸浮及貼壁細胞。1000rpm離心3min棄上清，Annexin V-F ITC 結合液重懸細胞，室溫避光孵育10min，離心，棄上清，Annexin V-F ITC結合液重懸細胞，PI冰盒中避光孵育10min，隨即上機檢測。每組檢測10000個細胞。

1.2.3逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測bcl-2、cyclin D1基因轉錄水平取對數生長期細胞，調整細胞濃度為(1×106)個/mL，接種于25cm培養瓶。分組方法為藥物干預組和對照組兩大組，其中干預組分別加入濃度為1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L的三氧化二砷。培養48h后，分別收集各組細胞，行RT-PCR檢測相關基因的表達。

①總RNA提取:以trizol法提取總RNA，1.2%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計測定A260/A280。確定RNA濃度和純度，純度為1.8~2.0。②cDNA 合成:20mL逆轉錄體系中，含有總RNA1μg，10μM oligo(dT)15 2μL，2.5mMeach dNTP2μL，5×First-Strand Buffer 4μL，0.1M DTT1μL，40U/μLRnase 0.5μL，200 U /μLTIANScript M-MLV 1μL，加ddH2O，至體積20μL。經70℃5min、42℃50min、95℃5min終止反應合成cDNA。③PCR擴增檢測bcl-2、cyclin D1基因的表達:PremierPrimer 5設計引物，bcl-2上游引物5’- TTGGATCAGGGAGTTGGAAG- 3’，下游引物5’- TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3’，擴增產物295bp;cyclinD1 上游引物5’-CTGGCCAT2GAACTACCTGGA - 3’，下游引物5’-GTCACACTTGATCACTCTGG-3’，擴增產物483bp;β肌動蛋白(β-actin)作內參照，上游引物5’- AAACTGGAACGGTGAAGGTG-3’，下游引物5’-GTGGCTTTT AGGATGGCAAG-3’，擴增產物160bp。PCR反應體系為:25μL，cDNA2μL，10pmol/μL的上下游引物各0. 5μL，10×Taq Buffer2.5μL，2.5mM dNTP Mixture 4μL，2.5U/μL Taq 0.5μL，補ddH2O至體積25μL。94℃預變性3min，94℃30s、58℃30s、72℃60s30個循環。72℃延伸5min。

PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker標記確定條帶大小。凝膠掃描成像分析系統進行攝像后并對凝膠條帶灰度信號強度半定量分析。以bcl-2/β-actin及cyclin D1 /β-actin的比值作為bcl-2、cyclin D1的相對表達強度。

1.3統計學處理

實驗數據以(χ±s)表示，采用SPSS13.0軟件分析處理數據，連續型變量比較采用t檢驗，多樣本均數比較采用單因素方差分析，分類變量比較采用卡方檢驗。P<0.05為統計學上差異有顯著性。

2結果

2.1三氧化二砷對細胞增殖活性的影響

MTT結果顯示，1μmol/L的三氧化二砷對SGC7901細胞增殖抑制作用較小。2μmol/L以上濃度的三氧化二砷對SGC7901細胞增殖有明顯抑制作用，且隨藥物濃度的提高，作用時間的延長其抑制率也相應增加，見圖1。

2.2Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率

Annexin V /P I雙染法設立陰性對照，雙側單標，陽性對照。右下象限為早期凋亡部分。雙染流式細胞計數結果顯示三氧化二砷可以誘導SGC7901細胞早期凋亡，隨著三氧化二砷濃度的增高，細胞凋亡數逐漸增高，1μmol/L組與對照組比較細胞凋亡數差異無顯著性(P>0.05)，而較高濃度組與對照組比較細胞凋亡數差異有顯著性(P<0.05)。提示低濃度三氧化二砷(≤1μmol/L)對細胞凋亡無明顯意義，而較高濃度的三氧化二砷(≥2μmol/L)與細胞凋亡率具有劑量依賴關系(P<0.05)。見表1、圖2。

2.3三氧化二砷對SGC7901細胞bcl-2、cyclin D1基因轉錄的影響

RT-PCR電泳條帶灰度分析半定量比較發現不同濃度的三氧化二砷作用48h后，bcl-2、cyclinD1基因表達下降，并且隨著三氧化二砷濃度的增加基因表達下降的程度也增加，見圖3。凝膠灰度圖像半定量分析bcl-2/β-actin和cyclin D1/β- actin的值:1μmol/L組和對照組相比無明顯差異(P>0.05)，而在較高濃度其比值有明顯差異(P<0.05)，見表2。

3討論

三氧化二砷已被廣泛證明是一種治療急性早幼粒性白血病的有效制劑[4-7]。2000年9月，三氧化二砷被美國食品及藥物管理局批準上市。近年來發現三氧化二砷除了能治療血液系統疾病，對多種惡性實體腫瘤也有強大的抗癌作用。MTT細胞增殖抑制實驗證實三氧化二砷對SGC7901細胞具有較強抑制作用。且與作用劑量和作用時間呈正相關。AnnexinV /P I雙標法結果顯示三氧化二砷作用于SGC7901細胞48h后可誘導細胞進入凋亡，增加藥物濃度可以明顯提高早期凋亡比率。提示三氧化二砷主要通過誘導細胞凋亡而抑制腫瘤細胞增殖。bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)基因是Bcl基因家族的一個重要成員，該基因是Tsujimoto等[8]于1984年從濾泡性淋巴瘤中(14，18)染色體易位的斷裂點克隆到的一個原癌基因。bcl-2作為抑制凋亡的基因，其過表達能延長細胞壽命，使已有DNA受損的細胞生存期延長，以致增加其他基因突變的機會，從而導致腫瘤的發生[9]。細胞周期調控的有序發生和細胞凋亡是保持基因穩定性的兩個重要因素，而基因組不穩定性正是腫瘤發生的根本原因之一[10]。細胞周期調節因子包括周期素(cyclin)、細胞周期素依賴性激酶(CDK)和細胞周期素依賴性激酶抑制因子(CDKI)，三者組成調控網絡，以CDK為核心，cyclin起正調控作用促進細胞增殖，CDKI起負調控作用抑制細胞增殖，共同調節細胞周期演進。cyclin D1基因是近年來提出的重要的原癌基因，其蛋白產物在細胞周期關鍵限速點G1/S 期轉換中起重要正調控作用[11]。Morisaki等[12]報道，胃癌細胞株中cyclin D1的下調，能抑制胃癌細胞的增殖，提示cyclin D1的過度表達能促進胃癌細胞的增殖。

我們的研究發現，三氧化二砷能抑制胃腺癌SGC7901細胞生長，對胃腺癌具有顯著的體外增殖抑制作用并誘導細胞發生凋亡，誘導胃腺癌SGC7901細胞凋亡的過程伴隨了bcl-2、cyclin D1基因表達的下調，提示三氧化二砷可能通過抑制bcl-2、cyclin D1的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤增殖。

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(收稿日期:2009-10-26)