中介素1-53對肺缺血再灌注損傷大鼠肺組織PPAR-γ表達的影響

[摘要] 目的 觀察中介素1-53對大鼠肺缺血再灌注損傷(LIRI)肺組織過氧化物酶增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的影響。方法 將健康Wistar 大鼠54 只隨機分為手術對照組(C組)、缺血再灌注組(IR組)、中介素干預組(D組)。每組分別在缺血45min、再灌注60min、120 min 3個時點處死6 只大鼠，觀察肺組織病理形態變化，觀察各組肺濕干質量比值(W/D)、CINC-1含量、PPAR-γmRNA、PPAR-γ蛋白的改變。結果 與IR組比較，中介素1-53預處理能夠明顯升高PPAR- γmRNA(P<0.05)，減輕肺水腫，并降低CINC-1蛋白含量(P<0.05)。結論 中介素1-53能上調PPAR-γ的表達，可能通過PPAR-γ的抗炎作用對LIRI起保護作用。

[關鍵詞] 肺缺血再灌注損傷;中介素1-53;過氧化物酶體增殖物激活-γ;保護作用

[中圖分類號] R364.1+2;R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)04-03-03

Effects of Intermedin1-53 on Pulmonary Peroxisome Proliferator-activated Receptor-γ Expression in Rat Lung Ischemia-reperfusion Injury

LIU NiLI JianqiangYANG ShujuanZHAO Hui

Department of Respiratory，the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of intremedin 1-53 on peroxisome proliferator-activated receptor-γ(PPAR-γ) in rat lung ischemia-reperfusion injury. Methods Fifty-four healthy Wistar rats were randomly divided into three groups:surgical control group(C group)， ischemia-reperfusion group(IR group)and intermedin-pretreated group(D group). At three time points(45 min ischemia，60 min and 120 min reperfusion)，6 rats from each group were killed，the lung histopathological changes were observed and the wet /dry weight ratio of lung tissue，CINC-1 content，PPAR-γmRNA and PPAR-γprotein in each group were determined. Results Compared with IR group，the pre-treatment by intermedin1-53 significantly increased PPAR-γmRNA(P<0.05)，and decreased interstital edema and CINC-1content(P<0.05). Conclusion Intermedin1-53 may upregulate PPAR-γexpression，which has protective effects on rat lung ischemia- reperfusion injury.

[Key words] Lung ischemia-reperfusion injury;Intermedin1-53;Peroxisome proliferator- activated receptorγ;Protective effects

中介素(IMD)是2004年由Roh等[1]用種系特征方法分析基因庫，從人類和其他脊椎動物基因組證實的一種新的降鈣素(CT)/降鈣素基因相關肽(CGRP)家族肽.IMD前體蛋白可被內源性肽酶降解為prepro-IMD95-147即IMD1-53，目前國內外有報道中介素1-53對油酸致急性肺損傷和心肌缺血再灌注損傷以及腎臟缺血再灌注損傷有保護作用[2-4]，但中介素1-53對肺缺血再灌注損傷的研究尚未見報道。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)屬于細胞核激素受體超家族的成員，在抗炎和免疫調節等方面有重要作用。本課題擬通過建立大鼠在體肺缺血再灌注模型，觀察肺組織PPAR-γ表達情況，旨在探討外源性人工合成的IMD1-53對肺缺血再灌注損傷的作用及其可能機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠54只(山西醫科大學動物中心提供)，體質量220～300g。

1.1.2主要試劑合成的大鼠中介素1-53(IMD1-53)(美國Phoenix pharmaceutical公司)，戊巴比妥鈉注射液(上海制劑三廠)，PPAR-γ兔抗鼠多克隆抗體、SP免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術公司)，CINC-1 ELISA試劑盒(美國RD進口分裝公司)，Trizol、dNTP、MMLV逆轉錄酶、Taq 酶、RNAsin 和Oligo(dT)15 Primer購自北京全式金生物技術有限公司;兩對PCR 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，見表1。

1.2實驗動物與分組

健康雄性Wistar大鼠54只隨機分為3組，每組18只。手術對照組(C組):開胸游離右肺門后，不行夾閉阻斷。缺血再灌注組(IR組):開胸游離右肺門后，夾閉阻斷45min，繼行再灌注120min。中介素干預組(D組):于缺血再灌注前1h將2nmol/kg的中介素1-53溶于1mL生理鹽水腹腔注入。

1.3動物模型的建立

健康Wistar 大鼠，3%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉后，尾靜脈注射肝素(100U/kg)。仰臥位固定，氣管切開后插管，接動物呼吸機行機械通氣吸入室內空氣，呼吸頻率60次/min，潮氣量單側肺通氣(8~10)mL/kg，雙側肺通氣(15~20)mL/kg，吸呼比為1∶2，然后經胸骨右緣第3～5 肋間開胸，離斷右肺下韌帶，游離右肺門，下穿手術線，靜息5min 后，于呼氣末結扎右肺門(右主支氣管，右肺動、靜脈)，夾閉45min 后開放，制成在體肺IR模型。

1.4標本采集及檢測方法

各組分別于缺血45min，再灌注60min、120min 3個時點采集標本。

1.4.1肺組織PPAR-rmRNA水平測定取大鼠右下葉肺組織迅速放入-70℃冰箱冷凍，留作RNA提取備用。①Trizol:常規一步法提取肺組織總RNA。②RT-PCR:經25℃ 10min，50℃ 50min，70℃15min在PCR 儀中逆轉錄合成第1條cDNA，以此為模板分別用PPAR-r引物和內參照3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物經PCR方法進行擴增，擴增條件:94℃預變性5min，94℃變性20s，退火溫度:PPAR-γ 52℃，GADPH 56℃退火20s，72℃延伸20s，共32個循環。③產物分析:取PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。經凝膠成像系統分析成像，以GAPDHmRNA的RT-PCR產物為內參照，以目的PPAR-γ片段與GAPDH 片段的條帶光密度(IOD)比值作為PPAR-rmRNA的相對量分別進行比較。

1.4.2 免疫組化法測肺組織PPAR-γ采用免疫組織化學染色(SP)法檢測大鼠肺組織PPAR-γ蛋白的表達。應用圖像分析系統進行分析圖像分析，以平均光密度值(IOD)表示。

1.4.3肺組織勻漿CINC-1含量冷凍肺組織稱重后，使用PBS(pH=7.4)緩沖液制成10%勻漿，離心，留取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定CINC-1含量。

1.4.4肺組織W/D比值測定取1g右肺中葉組織用分析天平稱重為濕質量，置于70℃電熱恒溫干燥箱中烤48h后稱重為干質量，濕質量與干質量之比即為W/D。

1.4.5病理檢查取右肺中葉約1cm×1cm×1cm 大小組織塊，用10%甲醛固定，予以常規石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.5統計學處理

計數資料以均數±標準差(χ±s)表示，采用SPSS16.0統計軟件進行多組資料的方差分析，各時點組間多重比較采用最小顯著差法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1肺組織PPAR-γ的表達

2.1.1肺組織PPAR-γmRNA的表達變化RT-PCR結果顯示電泳結果顯示在DNA標準222bp處，可見PPAR-γmRNA表達。在IR組缺血再灌注各時相，可見PPAR-γmRNA表達均較對照組明顯下降(P<0.05)，但在中介素干預后可見PPAR- γmRNA表達水平較IR組明顯升高(P<0.05)，但仍低于手術對照組，見圖1。

2.1.2肺組織PPAR-γ蛋白的表達變化PPAR-γ免疫組織化學反應陽性產物呈棕黃色顆粒，主要分布在細胞核內和核周。結果顯示，在手術對照組(C組)，肺組織表達高水平PPAR-γ蛋白，主要分布在肺泡上皮細胞、小支氣管上皮細胞，巨噬細胞和血管內皮細胞;在缺血再灌注組(IR組)再灌注120min則可見PPAR-γ蛋白表達較對照組下降(P<0.05)，而中介素干預后雖表達低于C組但明顯高于IR組。見表2。

2.2肺組織勻漿CINC-1含量

與手術對照組比較，IR組各時相點CINC-1含量明顯增加，具有統計學意義(P<0.05)，經IMD1-53干預后CINC-1含量明顯下降，具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3肺組織W/D

經缺血后，C組與IR組兩組大鼠肺組織W/D比值變化不顯著;再灌注后，IR組肺組織W/D比值明顯升高呈進行性;D組IMD1 -53干預后肺組織W/D比值較IR組明顯降低，但仍高于C組。

2.4肺組織病理學變化

光鏡下C組肺泡腔完整，肺泡間隔均勻一致，無明顯充血、水腫、炎性細胞浸潤。IR組肺組織損傷隨再灌注時間進行性加重，毛細血管充血，肺泡間隔明顯增厚，大量炎性細胞浸潤肺泡，腔內大量炎性細胞滲出、出血及滲液積聚。D組肺組織毛細血管充血，肺間質炎性細胞浸潤及肺泡腔出血、滲出均較相同時間點IR組明顯減輕。

3討論

本文實驗采用Eppinger方法，參考Sekido等模型[5，6]復制LIRI動物模型，從病理切片上觀察到缺血45min后即出現毛細血管充血，肺泡間隔炎性細胞浸潤，且隨著再灌注時間的延長，肺組織的損傷進行性加重，肺泡腔內大量炎性細胞滲出、出血及炎性細胞積聚。這些病理變化特點與文獻報道的急性肺缺血再灌注損傷早期病理形態改變一致，表明LIRI復制的模型是成功的。近來研究發現IMD1-53是一個重要的活性肽段，使用IMD1-53干預油酸致急性肺損傷大鼠，IMD1-53可能通過抑制中性粒細胞浸潤，抑制脂質過氧化反應，對油酸致急性肺損傷大鼠有一定保護作用[2];用IMD1-53灌流離體大鼠心臟具有正性肌力作用和擴張冠狀動脈效應，應用IMD1-53對離體心臟缺血再灌注損傷具有顯著的保護作用[3];這些實驗結果提示IMD1-53具有抗炎、抗氧化等作用，具有很強的臟器保護作用，但其具體機制尚不清楚。

本實驗中，我們用多種方法評價缺血再灌注損傷誘導的肺損傷，包括肺水腫程度(W/D)，肺組織病理形態學變化，以及炎癥細胞因子(CINC-1)，每個結果都表明IMD1-53預處理能夠明顯減輕缺血再灌注損傷引起的肺損傷。PPAR-γ是核激素受體超家族的成員之一，在肺中普遍存在，是肺部炎癥和修復的調節器，在抗炎和免疫調節方面有著重要的作用[7，8]，他的抗炎機制為:(1)PPAR-γ被激活后通過抑制轉錄因子比如NF-KB，信號轉導因子、STAT、以及AP-1的活化而調控下游靶基因的表達[9，10];(2)轉錄因子NF-KB調節急性炎癥發展中的許多早期應答產物的表達，NF-kB活性的失活抑制炎癥基因和炎癥因子的產生(TNF-a，環氧化酶2，CINC-1，以及細胞間黏附分子-1等)[11-13]，從而在一定程度上減少炎癥細胞募集、炎癥介質的產生，減輕組織損傷。

本實驗結果顯示，正常大鼠肺組織表達較高水平的PPAR-γmRNA，這與文獻報道相一致;肺經歷缺血45min后PPAR-γmRNA即開始下降，并持續至實驗結束;D組經腹腔注射IMD1-53預處理后PPAR-γmRNA表達較IR組增加但仍低于C組(P<0.05)，免疫組化法檢測肺組織PPAR-γ蛋白表達變化情況與PPAR-γmRNA變化基本一致，只是蛋白表達遲于轉錄水平2h。上述結果表明，IR組大鼠肺組織無論是在基因轉錄水平還是蛋白水平均較正常肺組織表達降低，提示PPAR-γ可能參與了LIRI的病理過程，而IMD1-53預處理可以上調PPAR-γ的表達，同時肺損傷參數的好轉，這些表明IMD1-53對肺缺血再灌注損傷的保護機制可能與PPAR-γ表達上調、激活有關。因此，本實驗的結果至少可以用如下解釋:IMD1-53激活PPAR-γ后部分通過拮抗轉錄因子如NF-kB、STAT以及AP-1等的活性從而減少了炎性細胞因子如CINC-1等的產生，從而抑制PMN與血管內皮的黏附及其向血管外遷移，抑制了PMN的聚集，減輕了肺組織損傷。

綜上所述，我們的實驗表明肺缺血再灌注損傷可以誘導急性肺部炎癥和肺損傷;PPAR-γ在肺組織表達的減少提示PPAR-γ可能參與了LIRI的病理過程;IMD1-53對肺缺血再灌注損傷有保護作用，并且能夠上調PPAR-γ在肺損傷大鼠肺組織中的表達，提示IMD1-53可能部分通過PPAR-γ途徑產生抗炎作用從而起到減輕肺損傷的作用。但IMD1-53與PPAR-γ相互作用的分子機制仍需進一步研究。

[參考文獻]

[1] Roh J，Chang CL，Bhalla A，et al. Intermedin is a calcitonin/ calcitonin gene-related pep tide family pep tide acting through the calcitonin receptor-like receptor/ receptor activity modifying protein receptor complexes[J]. Biol Chem，2004，279(8):7264-7274.

[2] 于曉敏，劉新民，齊永芬，等. 中介素1-53對油酸致大鼠急性肺損傷的保護作用[J]. 中華結核和呼吸雜志，2006，29(12):808-811.

[3] Yang JH，J ia YX，Tang CS，et al. Effects of intermedin1-53 oncardiac function and ischemia/reperfusion injury in isolated rathearts[J]. Biochem ical Biophysical Research Communications，2005，327:713-719.

[4] 陳斌，石洪波，張雪軍，等. Intermedin 預處理對大鼠腎缺血離體再灌注損傷的保護作用[J]. 臨床泌尿外科雜志，2008，23(5):38.

[5] Eppinger MJ，Ward PA，Jones ML，et al. Disparate effects of nitric oxide on lung ischemia reperfusion injury[J]. Ann Thorac Surg，1995， 60(5):1169.

[6] Sekido N，Mukadia N，Harada A，et al. Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against interleukin-8[J].Nature，1993，365(6447):654.

[7] Moraes LA， Piqueras L， Bishop-Bailey D. Peroxisome proliferator- activated receptor and inflammation[J]. Phar Ther，2006，110(3):371- 385.

[8] 姜鵬，王建春，錢桂生. 過氧化物酶增殖體激活受體與炎癥及免疫反應[J]. 生命的化學，2005，25(3):232 - 235.

[9] Ricote M，Li AC， Willson TM，et al. The peroxisomeproliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation[J]. Nature 1998，391:79-82.

[10] Jiang C，Ting AT，Seed B. PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines[J]. Nature 1998，391:82-86.

[11] Baeuerle PA， Baltimore D. NF-kappaB: ten years later[J]. Cell，1996， 87:13-20.

[12] Wang AC，Dai X，Luu B，et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma regulates airway epithelial cell activation[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24(6):688-693.

[13] Liu SF， Ye X， Malik AB. Inhibition of NF-kappaB activation bypyrrolidine dithiocarbamate prevents in vivo expression of proin flammatorygenes[J]. Circulation 1999，100:1330-1337.

(收稿日期:2009-11-12)