T細胞疫苗誘導異種胰島移植免疫耐受的實驗研究

[摘要] 目的 體外制備供體特異性T細胞疫苗(T cell vaccine)，探討T細胞疫苗免疫(T cell vaccination)誘導異種胰島細胞移植免疫耐受的作用。方法 腹腔注射鏈脲佐菌素誘導建立Balb/c小鼠Ⅰ型糖尿病模型，用酶消化法和密度梯度離心法無菌分離純化Wistar大鼠胰島細胞。制備Balb/c小鼠針對Wistar大鼠的T細胞疫苗:實驗隨機分為三組，G1:糖尿病小鼠對照組;G2:胰島細胞移植組，糖尿病小鼠+胰島細胞移植+1640培養液(對照組);G3:胰島細胞移植加T細胞疫苗免疫組，糖尿病小鼠+胰島細胞+T細胞疫苗(實驗組)，于d1，d7，d14，d21實驗組Balb/c小鼠接種TCV(1×107/mL)，對照組用1640替代。接種前和每次接種后第5d分別進行混合淋巴細胞反應。胰島細胞移植:將Wistar大鼠的胰島按1200～1500IEQ/kg經肝門靜脈導入小鼠體內，移植后觀測血糖和體重變化。結果 異種胰島細胞移植可以誘導I型糖尿病小鼠血糖降至正常水平且維持一段時間，對照組小鼠移植后(5.12±1.36)d即發生排斥，實驗組移植物存活時間達(20.25±3.45)d。結論 TCV能夠有效延長異種胰島移植物的存活時間，是一種潛在誘導異種胰島移植免疫耐受的方法。

[關鍵詞] T細胞疫苗;胰島細胞;異種移植;免疫耐受

[中圖分類號] R349.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)04-19-03

The Effects of T Cell Vaccination on Xenogeneic Islet Cell TransplantationHU Chunlei1ZHAO Zhenlin2

1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2.The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To explore the the effects of T cell vaccination on xenogeneic islet cell transplantation. Methods Balb/c mice (H2-d) were used as recipients and Wistar rats were used as donors. TypeⅠdiabetes mice model were made by injecting streptozotocin intravenously. Type Ⅰ diabetes mice were randomLy divided into three groups，Group A:Diabetic mice with no transplantation and no TCV， Group B: Islet cell transplantation +RPMI1640 culture medium， Group C(experimental group): Islet cell transplantation+TCV.T cell vaccine was made by using attenuated spleen lymphocytes from Balb/c mice which were challenged with Wistar rat spleen lymphocytes in vitro and were stimulated with Con A. Balb/c mice as recipients were immunized with TCV on the time points of d1，d7，d14，d21 and;RPMI1640 culture medium was used in control group. One-way mixed lymphocyte reaction(MLR) was performed with effector of immunized Balb/c mice peripheric lymphocytes and stimulator of Wistar rat peripheric lymphocytes on the second day of T cell vaccination. Islet cells were isolated from Wistar rat pancreas using the protocol of enzyme digestion and density gradient centrifμgation. Islet cells were transplanted into immunized Balb/c mice at the density of 1200～1500IEQ/kg by the way of portal vein injection. Recipient's blood glucose was monitored everyday and body weight was recorded weekly after transplantation. Results Xenogeneic islet cell transplantation can induce type I diabetic mice blood glucose to normal levels and remain for some time，the control group mice after transplantation(5.12±1.36) days， which happened rejection，the experimental group graft survival time of up to(20.25±3.45)days. Conclusion T cell vaccination can significantly prolong the survival time of xenogeneic pancreatic islet grafts;T cell vaccination is a potential approach to to induce xenogeneic islet transplant tolerance.

[Key words] T cell vaccine;Islet cell;Xenogeneic transplantation;Immune tolerance

異種移植為胰島移植治療I型糖尿病提供了充足的供體，但嚴重的排斥反應限制了這一方法的應用，應用常規的免疫抑制劑不能抑制異種免疫排斥反應，因此如何誘導免疫耐受成為一個重要課題。T細胞疫苗(TCV)是特異性抗原活化的反應性T細胞經過化學或物理方法處理滅活后制成的，是目前免疫耐受研究中較新的領域[1]。已有研究證明T細胞疫苗可以誘導同種異體移植免疫耐受[2-4]。本實驗通過T細胞疫苗誘導受體對異種胰島移植的免疫耐受狀態，探討TCV在誘導異種胰島移植免疫耐受中的可行性。

1材料與方法

1.1動物

供者為Wistar雄性大鼠，180～200g，由山西醫科大學生理教研室提供;受者為BALB/c(H-2d)雄性小鼠，20～25g;由中國醫學科學院動物研究所提供。

1.2試劑及藥品

胎牛血清(四季青公司);RPMI細胞培養基(HYCLONG);淋巴細胞分離液(TBD);絲裂霉素C(協和發酵工業株式);刀豆蛋白A(Sigma);鏈脲霉素(Sigma);ficoll400(sigma);膠原酶V(Sigma)。

1.3制備Wistar大鼠和Balb/c小鼠脾臟單個核淋巴細胞懸液

無菌取大鼠脾臟，研磨制成勻漿，Hanks液稀釋，200目不銹鋼網過濾，制成細胞懸液，10倍細胞壓積的比例加入紅細胞裂解液，充分吹打混勻后，Hanks液洗兩次，輕輕加入到淋巴細胞分離液上層密度梯度離心，收集界面層細胞，即為單個核淋巴細胞，Hanks液洗滌兩次，臺盼蘭拒染法鑒定活細胞數大于95%，RPMI1640培養液調細胞濃度至2×105/mL，絲裂霉素C(25μg/mL)37℃水浴45min滅活細胞，PBS洗滌3次，調細胞濃度至2×105/mL。同樣方法制備小鼠脾淋巴細胞懸液，調細胞濃度至2×105/mL，分裝于100mL的培養瓶內(5mL/瓶)，不行絲裂霉素處理。

1.4制備T細胞疫苗

滅活大鼠脾淋巴細胞5mL接種于小鼠淋巴細胞培養瓶內，混合后加入ConA2.5μg/mL，37℃，95%O2，5%CO2孵箱中培養48h 后收集細胞，然后加入絲裂霉素(25μg/mL)處理滅活細胞(37℃水浴45min)，RPMI1640培養液調細胞濃度至1×107/mL，制成供者特異性T淋巴細胞疫苗。

1.5小鼠Ⅰ型糖尿病模型的制備

將鏈脲霉素(STZ)用0.1mmol/l無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液配成2%溶液，調節PH4.5，濾菌器除菌。小鼠過夜禁食12h，按160mg/kg體重一次性腹腔注射STZ溶液，24h內隨機測血糖≥16.5mmol/l，穩定一周即可視為造模成功，作為受體。

1.6胰島細胞的獲取和分離純化

麻醉大鼠逆行注射膠原酶V10mL充盈胰腺組織，迅速完整取下胰腺組織，進一步去除脂肪和血凝塊，加體積兩倍的膠原酶V在37℃水浴鍋內震蕩消化15min，胎牛血清終止反應后100目不銹鋼網過濾，Hanks液和1640液洗滌離心，用Ficoll400液不連續密度梯度離心純化胰島細胞后重懸于20mL完全PPMI1640培養液中，37℃，95%O2，5%CO2條件下培養24h。

1.7實驗分組

T細胞疫苗免疫接種及異種胰島細胞移植 將Ⅰ型糖尿病模型小鼠隨機分為四組，每組8只，A組糖尿病小鼠，B組糖尿病小鼠+胰島細胞+1640培養液(對照組)，C組糖尿病小鼠+胰島細胞+T細胞疫苗(實驗組)，胰島移植前實驗組注射TCV(1×107/mL、0.2mL/次、1次/周)，連續3周，B組用1640液替代。第3次免疫后7d，B、C組經門靜脈穿刺按1200～1500IEQ/kg導入大鼠胰島細胞。

1.8單向混合淋巴細胞反應(MTT法)

接種前和每次接種后第5天進行單向混合淋巴細胞反應，Balb/c小鼠的脾細胞作為反應細胞，絲裂霉素處理的Wistar大鼠脾細胞作為刺激細胞，兩者細胞濃度均為1×106/mL。取96孔板，每孔加入刺激細胞和反應細胞各100μl，每份標本設3個復孔，在孵育箱中培養72h，終止前4h每孔加入MTT10μl，培養結束后加入二甲基亞砜150μl，37℃下振蕩20min，用酶標儀測每孔OD570值計算抑制率;抑制率=(1-實驗組OD/對照組OD)×100。

1.9小鼠血糖和體重的檢測

胰島細胞經門靜脈移植導入小鼠體內，每日相同時間點測空腹血糖，以非禁食血糖值≤10mmol/判定為移植物存活，移植有效;若連續2次血糖值≥11.1mmol/l為移植物排斥，以第一次的時間為排斥時間。每周相同時間點觀察小鼠的體重變化。

1.10統計學分析

數據以均數±標準差(χ±s)表示，實驗數據進行t檢驗、方差分析，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1單向混合淋巴細胞反應

t檢驗結果示:TCV組的平均OD值每次接種后比接種前有明顯下降(P<0.05)，隨著接種次數的增加抑制率有不斷增大的趨勢，對照組接種前后平均OD值無顯著變化(P>0.05)，免疫后TCV組相同時間點同空白對照組比較，平均OD值有明顯差異(P<0.01)。數據見表1。

2.2不同組間血糖控制水平的比較

方差分析(S-N-K法)結果示:移植組同非移植組之間的比較，A組與其他二組比較(P<0.001)，具有統計學意義。t檢驗結果示:相同時間點B、C組比較(P>0.05)。見表2。

2.3移植組有效控制血糖天數的比較

t檢驗結果示:C組與B組比較(P<0.05)，認為TCV可顯著延長異種胰島細胞移植存活的時間。見表3。

2.4不同組小鼠體重的變化趨勢圖

從趨勢圖中可以看出從造模成功到移植前3周，三組小鼠體重變化趨勢相似，移植胰島細胞后，非移植組體重隨著時間延長不斷下降，移植后的B、C組體重隨時間延長逐漸回升，但B組體重回升一段時間后又開始下降。見圖1。

3討論

T細胞疫苗誘導免疫耐受可能涉及以下幾個方面的機制:1)細胞免疫TCV可以誘導機體產生抗獨特型T細胞，抑制體內活化的獨特型抗原特異性T細胞，其中CD8+調節性T細胞在免疫應答的水平上對Th細胞表型進行調節，從而誘導免疫耐受的形成[5，6]。2)體液免疫TCV是由自身反應性T細胞經過化學或物理的方法滅活后制備而成的，本身表達一組特定的TCR，誘導機體產生針對TCR的抗體，也就是抗獨特型抗體，導致機體對某種特定抗原的免疫無應答，此作用具有明顯的抗原特異性。另外，TCV也具有與活化T細胞相同的表位，如IL-2R、IL-4R和CD4、CD8等黏附分子，誘導產生針對T細胞表面活化分子的抗體如IL-2R抗體等，此作用不具有抗原特異性[7，8]。另外有研究發現TCV可激活調節性T細胞誘導免疫耐受[9]，上述機制共同參與細胞凋亡的過程。在移植研究中，目前制備疫苗方法大多是先用供體抗原致敏受體，再收集相應部位的淋巴結細胞或脾細胞，用低濃度ConA 體外培養48h激活同種抗原特異性T 細胞，最后用化學或物理的方法滅活細胞。

本實驗運用體外培養的方法制作T細胞疫苗，以滅活的供體脾細胞作為刺激細胞，受體脾細胞作為反應細胞，兩者混合低濃度ConA刺激增值，形成供體抗原特異性T細胞，然后絲裂霉素滅活制成T細胞疫苗，實驗結果顯示，接種疫苗后抑制率隨免疫次數的增加而增加，第三次免疫后抑制率達到86.1%，說明接種疫苗后，小鼠對特異性抗原的免疫排斥反應降低。移植物存活時間實驗組同對照組比較有顯著延長，證實體外制備的TCV可以誘導受體產生抗原特異性免疫耐受，延長了移植物的存活時間。

與傳統方法比較，體外方法在體外用抗原刺激受體細胞制成供體抗原特異性T細胞，不僅避免反復致敏受體給機體帶來的痛苦，也縮短了疫苗制備的時間，更利于在臨床上的推廣應用。本次研究的創新在于用體外方法制備T細胞疫苗并誘導了異種胰島移植的免疫耐受，說明其有一定的可行性。但是與體內方法作用效果的比較，在制備疫苗過程中細胞的濃度、致敏受體時疫苗的最佳濃度等問題仍需進一步研究。

[參考文獻]

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(收稿日期:2009-10-23)