BMP-7與IL-6對人髓核細胞ColⅡ與TIMP-1基因表達的影響

[摘要] 目的 探討不同濃度BMP-7與IL-6作用于體外培養的人髓核細胞對Ⅱ型膠原與TIMP-1基因表達的影響。方法 應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)半定量檢測不同濃度BMP-7與IL-6作用下體外培養的人髓核細胞中TIMP-1和Ⅱ型膠原基因的表達量。結果 IL-6可以下調Ⅱ型膠原基因和 TIMP-1基因表達;低濃度的BMP-7可以抵消相同濃度IL-6對髓核細胞的保護作用，高濃度的BMP-7可以促進Ⅱ型膠原基因和TIMP-1基因表達。結論 BMP-7可以對抗IL-6作用和正向調節椎間盤細胞Ⅱ型膠原基因及TIMP-1基因表達，提示 BMP-7在臨床治療中可能具有逆轉早期椎間盤退變的作用。

[關鍵詞] IL-6;BMP-7;TIMP-1;Ⅱ型膠原;髓核細胞

[中圖分類號] R681.5+5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)04-24-03

Interaction of Bone Morphogenetic Protein-7 and Interleukin-6 on Gene Expression of TypeII-collagen and TIMP-1 in Human Nucleus Pulposus Cells in Vitro Cultured

FENG JunxiMA Xun*ZHANG LiWU XiaofeiHE Liming

Department of Orthopaedics，the Second Affiliated Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To discuss the interaction of different concentrations of bone morphogenetic protein-7(BMP-7) and interleukin-6(IL-6) on gene expression of typeⅡ-collagen and TIMP-1 in the in vitro cultured human nucleus pulposus cells. Methods We used the RT-PCR semi-quantitative detection of the gene expression levels of typeⅡ-collagen and TIMP-1 in the in vitro cultured human nucleus pulposus cells under the action of different concentrations of BMP-7 and IL-6. Results IL-6 reduced the gene expression levels of type II collagen and TIMP-1，and low concentration of BMP-7 could counteract the effects of the same concentration of IL-6 to protect the nucleus pulposus cells. High concentration of BMP-7 could promote the gene expression of typeⅡ-collagen and TIMP-1. Conclusion BMP-7 can antagonize the effects of IL-6 and regulate positively the gene expression of type II collagen an d TIMP-1 in the nucleus pulposus cells，suggesting BMP-7 could reverse the degeneration of intervertebral discs in the early stage of clinical treatment.

[Key words] Interleukin-6;Bone morphogenetic protein-7;Tissue inhibitors of matrix metalloproteinase-1;Type II-collagen;Nucleus pulposus cells

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)的病因十分復雜，其中細胞外基質成分的合成減少和降解增加是造成椎間盤退變的重要因素之一。隨著對椎間盤退變基礎研究的逐步深入，細胞外基質在椎間盤退變病理機制中的作用日益受到重視。關于TIMP-1及Ⅱ型膠原相關實驗證實，退變髓核細胞中TIMP-1和Ⅱ型膠原基因表達明顯減少。椎間盤退變過程中有多種因子共同參與，IL-6是一種重要的炎性因子，能抑制成纖維細胞合成膠原，通過影響椎間盤髓核組織中的基質降解酶的抑制酶而產生效應的[1];而骨形態發生蛋白(BMP-7)具有促進椎間盤細胞增殖及促進細胞外基質合成的能力[2]。本實驗主要觀察椎間盤退變過程中的重要參與者IL-6與BMP-7對TIMP-1與Ⅱ型膠原基因表達的影響，進一步探討IL-6 和BMP-7因子在椎間盤退變過程中的相互作用，為將來臨床有效的治療椎間盤退變提供理論和實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1組織來源人髓核組織取自3 例因脊柱側凸行前路矯形手術患者，年齡13～15 歲，術前MRI檢查證實實驗用椎間盤信號與正常椎間盤信號一致。根據椎間盤退變評分系統，可作為正常的髓核組織。取材時嚴格無菌操作，均在取材后2h 內進行分離培養。

1.1.2試劑DMEM/F12 1:1培養液(Hyclone)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶(Solarbio公司)，IL-6(Miltenyi Biotec公司)，引物合成(北京奧科生物技術有限責任公司)，Trizol試劑(TaKaRa公司，大連寶生)，隨機引物(Promega公司，USA)，逆轉錄酶M-MLV、Rnase抑制劑、DEPC水(TaKaRa公司，大連寶生)，Taq DNA 聚合酶(Fermentas公司，USA)

1.1.3儀器CO2培養箱(Heraeus)、倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司Olympus，Japan)、紫外分光光度計(Gene Company Limited公司，USA)、PCR儀(PE公司9700型，USA)、UVP凝膠成像儀(UVP公司，USA)、穩壓穩流電泳儀(Savant PS250，USA)。

1.2實驗步驟

1.2.1椎間盤細胞的分離和培養在嚴格無菌操作下，術中取出椎間盤2h內作為實驗材料。將取下的椎間盤用D-Hanks 液洗凈，將髓核與纖維環及纖維環交界區用眼科剪分離，并將髓核剪碎至組織塊小于1mm3，用0.25%的胰蛋白酶溶液于37℃水浴消化15min，隨后用0.2%Ⅱ型膠原酶消化4h，200目濾網過濾去除組織殘留碎塊。用DMEM/F12培養基加10%胎牛血清完全培養液終止消化，沖洗3次，加入培養液吹打均勻，計數后，將細胞分別接種于底面積為25cm2的培養瓶中，在37℃，體積分數5%的CO2培養箱(SANYO)中開始原代培養，隔2～3d換液。原代培養細胞達到90%融合時，加入0.25%胰酶，鏡下見胞質回縮，細胞間隙增大時，吸去消化液，加入少許培養液，用吸管吹打瓶壁細胞，使之脫落形成細胞懸液。計數后將懸液按1:2 分裝入培養瓶中繼續培養。

1.2.2實驗分組及處理細胞傳至第三代且培養細胞達到90%融合時，計數后將其轉至六孔培養板，每孔內約有2.5×105個細胞，并換用含12%胎牛血清的DMEM培養液，加入濃度分別為 ①0ng/mL (對照組);②IL-6組100ng/mL;③IL-6加BMP-7組 加入IL-6 100ng/mL同時加入BMP-7 100ng/mL;④IL-6加BMP -7組加入IL-6 100ng/mL同時加入BMP-7 1000ng/mL;⑤BMP-7組加入BMP-7 1000ng/mL，每個濃度三復孔，逐日于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態，共同孵育72h，收集細胞。

1.2.3逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptionnpolyme-rase chain reaction，RT-PCR)采用TaKaRa公司Trizol一步法說明提取各組收集細胞的總RNA，每份樣品取1μL稀釋至500μL，紫外分光光度儀測純度與濃度。取1μg 總RNA 用逆轉錄酶M-MLV進行逆轉錄，將逆轉錄產物cDNA模板1μL分別加入到總體積為25μL的反應體系中，混勻，離心，置于PCR儀內擴增，同時取等量cDNA擴增β-actin作為內參(各基因的引物序列及擴增片段見表1)。PCR反應條件:95℃ 2min預變性;然后95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 45s，共30個循環數;最后總延伸72℃ 10min。PCR產物加樣于2% 瓊脂糖凝膠進行電泳，紫外光凝膠成像系統掃描PCR 產物條帶灰度，以目的基因與β-actin的灰度比值進行半定量統計分析，比值表示目的基因的相對表達水平，比值越大，其表達程度越高。

1.3統計學分析

采用SPSS13.0統計軟件處理數據，計量資料用均數±標準差(χ±s)表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2結果

見圖1、2 及表2，圖3為β-acting。結果顯示IL-6組與1、3、4、5組相比有顯著差異，P<0.05;說明在椎間盤退變過程中IL-6起到重要作用;1、3組與4、5組相比有顯著性差異，P<0.05;說明隨著BMP-7濃度增高可以明顯促進人髓核細胞中TIMP-1與Ⅱ型膠原基因表達，從而增高Ⅱ型膠原表達量，延緩椎間盤退變;1組與3組相比差異不大，P>0.05，說明BMP-7可以對抗IL-6引起的椎間盤退變作用;4組與5組相比差異不大，P>0.05，說明低濃度的IL-6對高濃度TIMP-1影響不顯著，見表2。BMP-7可以對抗IL-6引起的椎間盤退變作用，并可以逆轉早期椎間盤退變。

3討論

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IDD)是一種發病率很高的疾病。目前認為椎間盤退變起源于髓核，髓核軟骨細胞對胞外基質的合成、分泌和轉歸起主導作用。多數研究認為髓核退變主要起因于髓核細胞和細胞外基質的改變，進而造成椎間盤生物力學異常，產生頸肩痛、腰腿痛等臨床表現。椎間盤內許多因子參與了IDD的形成，主要包括促進椎間盤退變的因子如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酶(matrix metallop roteinases，MMPs)等;抑制椎間盤退變因子，如胰島素樣生長因子、轉化生長因子β及骨形態發生蛋白家族(bone morphogen etic protein，BMPs)等[4]。隨著生活、工作習慣及年齡的改變使椎間盤內各種成分的表達水平發生了明顯的改變:促進椎間盤退變的因子合成增加，抑制椎間盤退變合成量減少，從而導致蛋白多糖和膠原合成減少、分解增加，最終出現IDD[5]。

近年來有研究表明IL-6是一種負性調節因子，可以引起軟骨基質的降解，促進軟骨的破壞。Kang等[6]研究發現，在突出椎間盤和正常椎間盤中IL-6均可表達，但突出椎間盤中分泌量較高。王民等[7]對體外培養正常及突出椎間盤組織觀察發現突出腰椎間盤細胞中IL-6 含量高于正常椎間盤細胞，提示IL-6可能參與了腰椎間盤的退變過程。本實驗結果顯示單獨加入IL-6作用后的人髓核細胞TIMP-1與Ⅱ型膠原基因的含量明顯比對照組少，說明IL-6可以通過影響椎間盤髓核組織中的基質降解酶的抑制酶而產生效應，進一步影響細胞的生長和分化，降低II型膠原的含量，這與Kamemoto[1]等的研究結果一致。

骨形態發生蛋白7(bone morphogenetic protein-7， BMP-7)是轉化生長因子β(transformation growth factors-β，TGF-β)超家族成員一組分泌蛋白，又名成骨蛋白1(OP-1)。以往的研究表明BMP-7可以有效促進椎間盤組織合成細胞外基質，從而能夠修復退變的椎間盤。Imai等[8]實驗研究證實BMP-7基因同樣具有促進細胞外基質合成、修復退變椎間盤的能力。我們的研究結果顯示，在培養的有致炎因子IL-6的人髓核細胞中同時加入相同濃度BMP-7時，TIMP-1與Ⅱ型膠原基因表達增加，與只加入IL-6組有明顯差異，但與對照組相比差異不明顯，這說明BMP-7可以拮抗IL-6的作用，對細胞起到了一定的抑制退變作用;隨著BMP-7劑量的增加，第四組與第三組相比，TIMP-1與Ⅱ型膠原基因表達有顯著差異，第五組與第四組相比差異性并不明顯，這說明隨著BMP-7濃度增高可以明顯促進人髓核細胞中TIMP-1與Ⅱ型膠原基因表達，但低濃度IL-6對高濃度BMP-7影響并不顯著;在生理條件下高濃度BMP-7可以完全對抗椎間盤退變，促進Ⅱ型膠原表達，從而為髓核細胞生長分化提供適合的生理環境，阻止退變進一步發展。

IDD是一個慢性發展、長期存在的病理改變。本實驗從IL-6與BMP-7共同作用于體外培養的髓核細胞方面進行了研究，證實了BMP-7在一定程度上可以抑制椎間盤退變，提示其在臨床治療中逆轉早期椎間盤退變的作用，為后續研究和臨床應用提供了一定依據;但BMP-7具有誘導成骨作用，大劑量、多次使用容易造成椎間盤骨化，怎樣避免這種情況發生還有待進一步研究;同時椎間盤退變是多因素共同參與的結果，IL-6、BMP-7與其他因子之間的關系還不是很清楚，需要更深入的探討研究。

[參考文獻]

[1] Kamemoto M. Immunocytochemical study of matrix metalloproteinase-3 and inhibitor of metalloproteinase-1 in human intervertebral disc[J]. Spine，1996，21(1):1-8.

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[7] 王民，李新友，劉淼，等. 白細胞介素-6在突出的腰椎間盤中的表達及其意義[J]. 中國脊柱脊髓雜志，2001，8(6):581-582.

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(收稿日期:2009-11-12)