HBsAg\\HBcAg的免疫熒光檢測在HBV-GN診斷中的應用

[摘要] 目的 觀察乙型肝炎病毒相關性腎炎(HBV-GN)患者腎臟組織中HBsAg、HBcAg的表達情況。方法 以50例HBV-GN患者為研究對象，另隨機選擇20例非乙型肝炎病毒相關性腎炎(NHBV-GN)患者作為對照組，用間接免疫熒光法檢測腎穿刺活檢組織HBsAg、HBcAg的表達。結果 HBV-GN患者腎組織中可檢測HBsAg、HBcAg陽性顆粒，陽性率分別70%(35/50)，24%(12/50);20例(NHBV-GN)患者腎臟組織HBsAg、HBcAg均未檢出。與HBV-GN差異有統計學意義(P<0.05)。結論 HBsAg、HBcAg免疫熒光標記是診斷HBV-GN的重要指標，HBV在腎組織內存在感染及復制，其在乙型肝炎病毒相關性腎炎的發病機制中具有重要作用。

[關鍵詞] HBsAg;HBcAg;乙型肝炎病毒相關性腎炎;腎臟;免疫熒光

[中圖分類號] R446.8[文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)04-12-03

Application of HBsAg and HBcAg Immune Fluorescence Detection in Diagnosis of Hepatitis B Virus Associated Glomerulonephritis

CHEN Yupeng1CHEN Hong1WANG Xingfu1ZHANG Sheng1PENG Weihua2ZHENG Ke1

1.Department of Pathology， the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350005，China; 2.Department of Nephrology，Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region，Fuzhou 350025，China

[Abstract] Objective To observe the HBsAg and HBcAg expression in the renal tissue in hepatitis B virus associated glomerulonephritis(HBV-GN). Methods We selected 50 cases of HBV-GN as research group and the other randomly selected 20 cases of non-HBV-GN(NHBV-GN)as control group and used indirect immunofluorescence assay to detect the HBsAg and HBcAg expression in the renal puncture biopsies. Results The HBsAg and HBcAg-positive particles in the HBV-GN renal tissue could be detected，with the positive rates of 70%(35/50)and 24%(12/50)，while HBsAg and HBcAg failed to be detected in the kidney tissue of 20 cases of NHBV-GN，with a significant difference between the two groups(P<0.05). Conclusion The immune fluorescence detection of HBsAg and HBcAg is an important indicator in the diagnosis of HBV-GN. HBV plays an important role in the kidney tissue infection and replication and the pathogenesis of HBV-GN.

[Key words] HBsAg;HBcAg;Hepatitis B virus related glomerulonephritis;Renal tissue;Immunofluorescence

乙型肝炎病毒相關性腎炎(HBV-GN)是指乙型肝炎病毒感染人體后，病毒抗原HBsAg、HBcAg、HBeAg與體內相應抗體形成免疫復合物沉積在腎組織中，引起免疫復合物性腎小球腎炎[1，2]。本次研究以50例HBV-GN患者為研究對象，另隨機選擇20例非乙型肝炎病毒相關性腎炎(NHBV-GN)患者(剔除狼瘡性腎炎等引起HBsAg、HBcAg非特異性沉積的腎炎)作為對照組，用間接免疫熒光法檢測腎穿刺活檢組織HBsAg、HBcAg的表達，以探討HBsAg、HBcAg的免疫熒光檢測在乙型肝炎病毒相關性腎炎診斷中的應用。

1材料與方法

1.1材料

收集2008年5月～2009年5月南京軍區福州總醫院腎內科收治患者50例，所有病例均經HBV血清學檢測證實存在HBV感染，并在B超引導下行經皮腎穿刺活檢術，腎組織分別進行組織學、免疫熒光及超微病理檢查。20例非乙型肝炎病毒相關性腎炎(NHBV-GN)患者作為對照組，為福建醫科大學附屬第一醫院腎臟穿刺活檢組織。

1.2試劑

①鼠抗人HBsAg(1∶50)，山羊抗鼠IgG/FITC(1:75);兔抗人HBcAg(1∶50)，山羊抗兔IgG/FITC(1∶75)，購自DAKO公司。②Polyclonal Rabbit Albumin/FITC(1∶50)購自DAKO公司。③0.01mol/L(pH 7.2～7.4)PBS。④抗體稀釋液(S3022 DAKO公司)。⑤緩沖甘油:1份0.1mol/L(pH 8.0)PBS與9份甘油混勻。

1.3儀器

Leica CM3050冷凍切片機，Olympus BX61熒光顯微鏡+DP70數碼攝像機。

1.4方法[3]

①腎組織冷凍切片在室溫下稍風干后，在室溫下用冷丙酮固定10min。②PBS沖洗2×3min。③分別滴加鼠抗人HBsAg、兔抗人HBcAg，室溫孵育30min。設立Albumin作對照排除。④PBS沖洗2×3min。⑤分別滴加山羊抗鼠IgG/FITC、山羊抗兔IgG/FITC，室溫避光孵育30min。⑥PBS沖洗2×3min。⑦緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察結果。

1.5統計學處理

數據采用SPSS11.5軟件包進行χ2檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

HBV-GN患者腎組織中可檢測HBsAg、HBcAg陽性顆粒，陽性率分別70%(35/50)，24%(12/50);20例(NHBV-GN)患者腎臟組織HBsAg、HBcAg均未檢出。與HBV-GN相比差異有統計學意義(P<0.05)。結果見圖1、2，表1。

3討論

乙型肝炎病毒感染在我國高發，由其所引發的乙型肝炎病毒相關性腎炎(HBV-GN)較常見[4]，HBV-GN是HBV感染后主要的肝外臟器病變[5]。HBV-GN的發病機制目前尚不十分清楚，據文獻報道其發病機制[6]為:①免疫復合物介導的炎癥反應是目前公認的發病機制之一;②系膜區及內皮下的循環免疫復合物的沉積;③上皮下原位免疫復合物形成;④HBV感染腎組織后原位表達抗原;⑤自身的免疫反應;⑥細胞免疫缺陷;⑦遺傳因素;⑧生物社會學因素。目前HBV-GN在國際上尚無診斷標準，國內學者參考中華醫學會兒科學分會腎臟病學組提出以下診斷條件[7]:①血清HBV標志物陽性;②患腎小球腎炎，并可除外狼瘡性腎炎等繼發性腎小球疾病;③腎組織中找到HBV抗原或HBV-DNA;④腎組織病理為膜性腎病。符合①②③條即可確診，無論其腎組織病理類型如何，若符合第①②④條時，盡管其腎組織中未查到HBV抗原或HBV-DNA，可作為擬診。其中第③條是確診HBV-GN的必備條件。腎組織內檢測到HBV-DNA提示HBV的直接感染[8]。Wang等[9]研究表明，HBV不僅通過形成免疫復合物導致腎損害，也可直接感染腎組織參與腎病進展。在HBV-GN的腎小球內皮細胞、系膜細胞和腎小管上皮細胞中均能檢測出游離型和(或)整合型的HBV-DNA[10]，并發現HBsAg陽性顆粒的分布與HBV-DNA基本一致[11]。

HBsAg、HBcAg的免疫熒光檢測采用間接法檢測，此法是直接法的重要改進，先用特異性抗體與腎組織結合，形成抗原-抗體復合物，再用針對一抗的標記熒光素的二抗與上述抗原-抗體復合物結合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復合物，發出熒光，在熒光顯微鏡下觀察。間接法較直接法敏感5～10倍，而且只需要一種標記的熒光抗體[12]。此法的缺點是:容易引起非特異性染色。實驗過程中采用NHBV-GN患者(選擇肯定無HBsAg、HbcAg沉積的病例)作為對照組，同時應用Polyclonal Rabbit Albumin/FITC作對照排除。以保證結果的正確判讀。

本次研究結果顯示，HBV-GN患者腎組織中可檢測到HBsAg、HBcAg陽性顆粒，陽性率分別70%(35/50)，24%(12/50);20例(NHBV-GN)患者腎臟組織HBsAg、HBcAg均未檢出。與HBV-GN相比差異有統計學意義(P<0.05)。免疫熒光染色可見到HBsAg、HBcAg不同程度沉積在腎小球系膜區、毛細血管基底膜或內皮下。HBsAg與HBcAg的分子量較大，且帶有負電荷，因此它們形成的免疫復合物很難穿透腎小球基膜，主要沉積于內皮下及系膜區引起系膜毛細血管性腎炎或系膜增生性腎炎[13]。HBsAg以系膜區沉積為主[2]，HBcAg主要沉積在基底膜區，HBcAg陽性率明顯低于HBsAg。

HBsAg、HBcAg免疫熒光標記是診斷HBV-GN的重要指標。HBsAg和HBcAg與HBV-GN的關系較大。HBsAg是HBV-MN和HBV-MPGN的主要抗原，HBV-MsPGN及HBV-IgAN的致病抗原是HBsAg和HBcAg。現檢測HBV 抗原主要依靠免疫組化及間接免疫熒光法，本次研究采用間接免疫熒光法，這是目前應用較廣的免疫熒光技術[14]，除靈敏度高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于多種第一抗體的標記顯示，同時可提高各種HBV-GN的檢出率，為國際上公認的腎活檢病理診斷和研究的重要染色手段，值得推廣應用。

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(收稿日期:2009-08-13)