阿折地平對自發性高血壓大鼠心肌細胞凋亡的影響

[摘要] 目的 探討阿折地平對自發性高血壓大鼠心肌細胞凋亡的影響。方法 將自發性高血壓大鼠隨機分為治療組[阿折地平3mg/(kg·d)溶于生理鹽水中灌胃]、SHR組，另選WKY大鼠為正常對照組，每組10只。分別每周測大鼠血壓，10周后處死測其左心室肥厚指數，計數細胞凋亡數，ELISA法檢測心肌細胞TNF-α的表達。結果 SHR組與WKY組血壓無明顯改變，治療前后比較亦無明顯差異(P>0.05)，治療組的血壓較治療前顯著降低(P<0.01)，與WKY組比較無明顯差異，治療組左心室肥厚指數、細胞凋亡指數及TNF-α的表達顯著小于SHR組(P<0.01)，治療組與WKY組比較無顯著性差異(P>0.05)。結論 阿折地平能有效的控制血壓，能有效的抑制高血壓所致的左心室肥厚、細胞凋亡及心肌TNF-α的表達。

[關鍵詞] 阿折地平;細胞凋亡;大鼠

[中圖分類號] R972[文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)04-29-03

Effects of Azelnidipine on Cardiomyocyte Apoptosis of Spontaneously Hypertensive Rats

HU LianfenLIU Guangde

Department of Cardiology，Zhuhai Municipal People’s Hospital，Zhuhai 519000，China

[Abstract] Objective To explore the effect of Azelnidipine on cardiomyocyte apoptosis of spontaneously hypertensive rats(SHR). Methods Twenty SHRs were randomly divided into 2 groups(treatment group and SHR group，with 10 rats in each) and treated with Azelnidipine for 10 weeks and control group(10 WKY rats) was treated with 0.9% sodium chloride solution.The rat blood pressure was measured every week. The rats were sacrificed after 10 weeks，the left ventricular hypertrophy index was measured，the number of cell apoptosis was counted，and the expression of myocardial cell TNF-αwas detected by ELISA. Results Compared with the control group，Azelnidipine could significantly reduce the 1eft ventricular hypertrophic index，cardiomyocyte apoptosis and TNF-α(P<0.01). Conclusion Azelnidipine can effectively control blood pressure，which will inhibit hypertension-induced left ventricular hypertrophy，apoptosis，and myocardial expression of TNF-α.

[Key words] Azelnidipine;Apoptosis;Rat

原發性高血壓病(primary hypertension)是嚴重危害我國人民健康最常見的心血管疾病之一。長期高血壓可導致以左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)為主要特征的心臟病變;WHO已將逆轉LVH及心功能異常、保護靶器官作為治療高血壓病的主要目標之一，因此LVH的逆轉成為高血壓研究領域的新熱點。阿折地平是一種新型二氫吡啶類鈣拮抗藥，國外學者研究表明阿折地平對自發性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)的腎臟和心肌缺血的狗具有明顯的器官保護作用[1，2]。這種作用是否通過削弱高血壓發展過程中的心肌細胞凋亡，以及TNF的表達而實現，本實驗就其具體機制進一步研究，為阿折地平在我國引進后的大規模臨床應用提供試驗依據。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組

14周齡雄性SHR大鼠(上海斯萊克實驗動物中心提供)隨機分為兩組，SHR組(n=10)和阿折地平組(治療組，n=10);另選同源同系、血壓正常的Wistar-Kyoto大鼠(WKY)，作為正常對照組(WKY組，n=10)。

1.2實驗方法

阿折地平組:阿折地平(浙江健翔醫藥科技有限公司生產)3mg/(kg·d)溶于生理鹽水中灌胃;SHR組和WKY組以等容量生理鹽水灌胃。給藥或對照劑持續時間為10周，直到鼠齡24周。

1.3觀測指標

1.3.1一般項目觀察大鼠的一般狀況，用BP-6無創血壓測試儀(成都泰盟科技有限公司提供)測定大鼠的尾動脈血壓。實驗前測定大鼠體重，實驗后測定大鼠體重及左心室肥厚指數(左心室濕重/體重，LVW/BW，mg/g)。

1.3.2心肌細胞凋亡的檢測按常規病理組織學方法制備心肌石蠟標本。TUNEL檢測按試劑盒(武漢博士德分裝)推薦的方法進行。TUNEL陽性反應為核呈棕褐色或棕黃色顆粒，核呈TUNEL陽性反應且具備細胞凋亡的形態學特征者被判定為凋亡細胞。在每張玻片上隨機取4個視野，計數每個視野凋亡細胞的總數，并計算凋亡指數。

1.3.3ELISA法檢測心肌細胞TNF-α的表達取100mg心肌組織/樣本，提取心肌蛋白，用BCA蛋白定量液進行蛋白定量。嚴格按ELISA試劑盒檢測程序測定TNF-α含量。結果判定是用ELX-800型酶聯免疫儀，在490nm波長下讀取光密度，結果以心肌組織蛋白含量標準化，其結果以ng/mg蛋白表示。重復上述實驗3次。

1.4統計學處理

數據以均數±標準差表示，結果采用方差分析或t檢驗。

2結果

2.1阿折地平對高血壓大鼠血壓的影響

經阿折地平治療10w后，SHR組與WKY組血壓無明顯改變，治療前后比較亦無明顯差異(P>0.05)，但阿折地平治療組的血壓較治療前顯著降低(P<0.01)，與WKY組比較無明顯差異，見圖1。

2.2阿折地平對高血壓大鼠左心室肥厚指數的影響

治療10周后治療組左心室肥厚指數顯著小于SHR組(P<0.01)，治療組與WKY組比較無顯著性差異(P>0.05)。

2.3凋亡細胞計數

治療10周后治療組、SHR組、WKY組的心肌細胞凋亡指數分別為(104.34±35.38)‰、(502.13±54.84)‰和(23.13±12.25)‰。治療組和SHR組心肌細胞凋亡指數明顯地高于WKY組(P<0.01)，而治療組大鼠心肌細胞凋亡指數明顯低于SHR組(P<0.05)。

2.4阿折地平對高血壓大鼠TNF-α表達的影響

治療10周后治療組TNF-α的表達顯著小于SHR組(P<0.01)，治療組與WKY組比較無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

阿折地平(Azelnidipin)是2003年日本Sankyo公司與Ube公司聯合開發的一種新型二氫吡啶類鈣拮抗藥，選擇性作用于L-型鈣通道，在日本已被批準用于治療高血壓，其降壓療效與腎上腺素β受體阻斷劑和血管緊張素(angiotensin，AngⅡ)轉換酶抑制劑相當。阿折地平對自發性高血壓大鼠的腎臟和心肌缺血狗具有明顯的器官保護作用[1，2]。阿折地平具有抗氧化特性，通過減弱局部氧化應激和抑制單核細胞趨化蛋白-1的過度表達，抑制動脈粥樣硬化的形成[3，4];在體外，阿折地平也能減弱單核細胞趨化蛋白-1誘發的血管平滑肌細胞增殖和轉移[4];在人類臍靜脈上皮細胞，阿折地平通過降低NADPH氧化酶介導的活性氧簇抑制腫瘤壞死因子(TNF-α)活性和白細胞介素-8(IL-8)的表達[5，6]及內皮細胞炎癥反應[7];在糖尿病大鼠，阿折地平通過抑制氧化應激而改善大鼠對葡萄糖的耐受性[8];在卒中型自發性高血壓大鼠中，阿折地平治療能夠減弱交感神經反射，使腦、心臟和大動脈的內皮型氧化亞氮(eNOS)的生成增加[9-11]。

實驗表明，高血壓病心肌肥厚除了與間質增生，還與心肌細胞個體增大和凋亡的失衡有密切的關系。在血壓升高早期心肌細胞以個體增大為主，凋亡相對不足[12]。新的研究發現，SHR的心臟由高血壓發展為左心室肥厚(LVH)，再發展到心力衰竭(CHF)的過程中，其心肌細胞增殖與凋亡存在明顯的“時間窗”:1月內與5～17月以心肌細胞增大為主;1～4月與18月以后以凋亡為主。SHR出現LVH而尚未進展為CHF時，其心肌細胞凋亡指數與左心室心肌肥厚指數呈顯著負相關，出現CHF后則心肌細胞凋亡明顯增多[13]。

細胞凋亡又稱細胞程序性死亡[14]，是由遺傳決定的生理性死亡。近年來的研究[15，16]表明，心肌細胞的凋亡參與高血壓LVH的病理生理過程。高血壓時，心肌和內皮、平滑肌細胞異常凋亡，一些散在的、選擇性心肌細胞首先凋亡，釋放ATP，又進一步刺激鄰近的心肌細胞凋亡，形成惡性循環。凋亡心肌被膠原纖維取代，產生心肌纖維化、心肌肥厚。本實驗表明阿折地平能顯著的減少高血壓時心肌細胞的凋亡數。

腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種主要由單核-巨噬細胞分泌的具有多種生物學效應的細胞因子，已知TNF-α能誘導心肌細胞凋亡[17]，雖然正常心肌很少或不表達TNF-α，但在高血壓時，由于RAS系統激活，AngⅡ可以促使培養的心肌細胞在蛋白水平和mRNA水平表達TNF-α顯著增高[18]。

本實驗表明新型二氫吡啶類鈣拮抗藥阿折地平能有效的控制血壓，能有效的抑制高血壓所致的左心室肥厚、心肌細胞凋亡和心肌TNF-α的表達。但其具體機制仍有待進一步研究。

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(收稿日期:2009-10-28)