UCA1在膀胱癌中的表達及臨床意義

[摘要] 目的 探討UCA1 mRNA在膀胱移行細胞癌中的表達及其與病理分級、臨床分期和復發的關系。方法 采用SYBR GreenⅡ實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應試驗方法檢測39例膀胱癌組織及8例膀胱正常組織中UCA1 mRNA的表達情況。結果 39例膀胱癌組織中UCA1 mRNA表達陽性39例，陽性率分別為100%;8例膀胱正常組織中UCA1 mRNA表達陽性3例，陽性率分別為37.5%;UCA1 mRNA的表達在癌組織和正常組織中的陽性率比較差異有顯著性(P<0.05);UCA 1mRNA的表達與病理分級、臨床分期和復發關系密切(P<0.05)。結論 UCA1參與了膀胱癌的發生發展過程，對膀胱癌的診斷、判斷病理分級、臨床分期和預后具有重要臨床意義。

[關鍵詞] UCA1;膀胱癌;實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應;SYBR GreenⅡ

[中圖分類號] R737.14 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)04-16-03

UCA1 Expression in Bladder Cancer and Its Clinical Significance

WANG BaosenXING JinchunZHENG Jiaxin

Department of Urology，the Affiliated Xiamen First Hospital of Fujian Medical University，Xiamen 361003，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of UCA1 mRNA in bladder transitional cell carcinoma and its relationship with pathological grade，clinical stage and recurrence. Methods The SYBR Green II real-time fluorescent quantitative RT-PCR was used to evaluate the UCA1 mRNA expression in 39 cases of bladder transitional cell carcinoma and 8 cases of normal tissue. Results All of 39 cases of bladder transitional cell carcinoma cases showed the positive expression of UCA1 mRNA，with the positive rate of 100%，and 3 of 8 cases of normal tissue showed the positive expression of UCA1 mRNA，with the positive rate of 37.5%. There was a significant difference in the positive rate of between the two(P<0.05). There was a close relation between the pathological grade(P<0.05)， the clinical stage(P<0.05)and recurrence(P<0.05). Conclusion UCA1 is involved in the development and progression of bladder transitional cell carcinoma and it is of important clinical significance in the diagnosis of bladder transitional cell carcinoma and the judgement of pathological grade，clinical stage and prognosis.

[Key words] UCA1;Bladder cancer;Real time quantitative RT-PCR;SYBR Green Ⅱ

UCA1(urothelial carcinoma associated 1)是最近發現的一個新的膀胱癌的特異性非編碼基因，本文運用SYBR GreenⅡ實時熒光定量RT-PCR的方法檢測39例膀胱癌組織及9例膀胱正常組織中UCA1 mRNA，探討其表達與膀胱癌臨床分期和病理分級的關系，進一步為膀胱的診斷、治療和預后提供臨床依據。

1材料與方法

1.1標本來源

選取我院2008年10月～2009年9月術后病理證實為膀胱癌的膀胱癌標本39份，其中膀胱腫瘤電切的標本31份，行全膀胱手術的腫瘤標本8份，初發28例，復發11例。所有膀胱癌患者中男32例，女7例。年齡(60.72±13.19)歲。根據腫瘤浸潤深度可分為表淺型(Tis、Ta、T1)和浸潤型，其中表淺型26例，浸潤型13例。病理情況根據WHO/ISUP分級法，其中高級別尿路上皮癌9例，低級別尿路上皮癌(包括低度惡性傾向尿路上皮乳頭瘤)30例;膀胱正常組織8份，其中1份前列腺增生患者正常膀胱組織，其余7份為膀胱腫瘤邊緣3cm以外的正常膀胱組織，其中男6份，女2份，年齡(63.75±12.45)歲。所有標本在手術切除后立即取材放入RNA保存液然后保存于-70oC低溫冰箱中保存。

1.2試劑和儀器

總RNA提取試劑盒(離心柱型)(TIANGEN，廈門泰京生物技術公司)，PrimeScript TMRT reagent kit and SYBR○R Premix Ex Taq TMII(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)，低溫離心機(德國SIGMA公司)、UV-2450分光分度儀(日本島津公司)、Bio-Rad Thermal Cycler(美國伯樂公司)、Roche Light Cycler480 熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)等。

1.3方法

1.3.1總RNA的提取及濃度測定使用離心柱型總RNA 提取試劑盒，得到35μL 總RNA，然后取5μL稀釋20倍后用UV-2450分光分度儀進行純度(OD260/OD280)和濃度[(OD260 -0.024)*20]測定。

1.3.2逆轉錄cDNA使用 PrimeScript TMRT reagent kit試劑盒，10μL反應體系包括6xPrimeScript TM buffer 2μL，Random 6mers(100uM)0.5μL、PrimeScript TMRT Enzyme 0.5μL、Oligo dT primer 0.5μL、加入總RNA 500ng/(RNA濃度)，加RNase Free dH2O至10μL，反應條件37oC 15min，85℃ 5sec， 最后降至4℃，逆轉錄完成后加dH2O 40μL將其稀釋5倍-20℃保存。

1.3.3實時PCR運用NCBI Primer Design Tool 設計引物，UCA1 Forward primer GCTTAGGCTGGCAACCATCA，Reverse primer AAGCTGAGGCTGGCAAAGAG;GAPDH Forward primer GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，Reverse primer GAAGATGGTGGG ATTTC，分別擴增190bp和226bp片段長度，引物送Ivitrogen公司合成。運用SYBR GREEN II real time PCR 法，反應條件:10μL反應體系中含有SYBR○RPremix Ex TaqTM Ⅱ 5μL，PCR Forward Primer和 PCR Reverse Primer 各0.4μL，dH2O 3.2μL，DNA 模板1μL，擴增條件95℃ 5sec，60℃ 15sec， 72℃ 15sec，共45個循環。熔解曲線條件95℃ 5sec、4.4℃/s， 65℃ 1min、2.2℃/s。

1.4結果判定

Roche Light Cycler480熒光定量PCR儀檢測結果由Light Cycler軟件系統進行分析，相對定量采用比較Cp值法，即以目的基因UCA1 mRNA Cp值和內參基因GAPDH mRNA Cp值的比值R作為評價表達水平的標準，通過分析熔解曲線來判斷PCR產物特異性，擴增出了單一產物，未出現其他異常波形，波的形狀銳利，說明反應特異性好。

1.5統計學分析

數據分析使用SPSS 13.0統計軟件，兩組間陽性率的比較用χ2檢驗;偏態分布的數據采用中位數(M)及四分位間距(QR)，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗;P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1FQ-RT-PCR檢測結果

見圖1。S型曲線表示有mRNA擴增，陰性對照及陽性對照在45個循環結束時均未出現S型曲線屬正常結果，其擴增產物的特異性通過熔解曲線判定見圖2。UCA1和內參GAPDH兩對引物在同一體系中均擴增出了單一產物，未出現其他異常波形，波峰形狀銳利，說明反應特異性好。8例膀胱正常組織中UCA1 mRNA陽性表達3例，陽性率37.5%;39例膀胱癌組織中UCA1 mRNA陽性率100%，正常組織和癌組織UCA1 mRNA陽性率比較用χ2檢驗，χ2=21.10，P<0.05，兩者比較有顯著性差異，說明UCA1可作為膀胱癌診斷的檢測指標，對膀胱癌的診斷具有重要的意義。

2.2UCA1 mRNA在39例不同分級、分期及初發和復發膀胱癌組織的表達情況

見表1。結果顯示，其在不同病理分級、分期及其在初發和復發癌組織的表達均有統計學意義，UCA1對膀胱癌進展程度判斷的具有重要意義，其可能通過某種機制對膀胱癌的復發有關。

3討論

膀胱癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在泌尿系腫瘤中位居第1位[1]，其主要的病理類型是膀胱移行細胞癌，約占90%以上，其發生、發展是多基因共同作用的結果。目前對于膀胱癌的診斷除了CT和MRI以及膀胱鏡檢查外尚缺乏一個理想的分子標志物，但是CT和MRI的診斷率較低，而膀胱鏡檢查敏感性低且為有創檢查，易增加尿路感染的機會，其特異性也易受標本收集和尿路感染等影響。在大多數情況下以淺表性膀胱移行細胞癌出現，雖然它可以很容易的通過膀胱腫瘤電切手術切除，但膀胱癌具有復發率較高的特點，且復發后腫瘤惡性度增高，浸潤和轉移等惡性行為有所增強。據文獻報道5年復發率超過60%，15年的復發率超過80%，而在這些復發的膀胱癌患者中，約10%～30%進展為浸潤性膀胱癌[2-3]。目前雖然有許多潛在的生物標記物可以用來判斷膀胱癌的進展和預后，但是迄今沒有一個可靠的分子標記物可以用來檢測膀胱癌的發生發展和復發以降低病人的死亡率[4]。

近年來，許多研究突出強調了長片段(400bp)非編碼RNA在腫瘤形成過程中起重要作用，暗示其可以被用來作為腫瘤標志物[5-6]。目前關于非編碼RNA在膀胱腫瘤中研究卻相對較少，王凡等[7]運用抑制性雜交消減技術從膀胱移行細胞癌細胞株BLZ -211和BLS-211中分離出一個新的表達序列表簽(基因序列號DR159656)，UCA1(urothelial carcinoma associated 1)是基于該已表達序列表簽從BLZ-211細胞基因序列中克隆鑒別出的一個非編碼RNA，亦為一個膀胱癌特異性基因，通常高表達于胚胎組織、大多數胎兒組織和膀胱癌組織中，但在胎兒出生后，UCA1表達開始逐漸降低至消失，在成人僅高表達于膀胱癌組織，UCA1這種基因表達形式的時間性和空間性類似于ncRNA H19[8]，暗示它是一個癌胚基因;在BLS-211細胞株的研究中，UCA1基因的外源性表達提示它具有致瘤性、侵襲潛能并與藥物耐藥性有關，在膀胱癌的浸潤和進展過程中起一定的作用。UCA1具有較好的穩定性，并且很少受到腫瘤遺傳異質性的影響，在正常組織、泌尿系其他疾病如前列腺增生癥、腺性膀胱炎等和其他類型腫瘤尤其是腎臟腫瘤中均低表達，使其在膀胱移行細胞癌患者與正常人和其他的泌尿系腫瘤的鑒別中具有重要意義[9]。本研究通過應用實時熒光定量PCR技術檢測UCA1 mRNA 在膀胱癌患者癌組織和正常組織中表達情況，證實UCA1 mRNA在膀胱癌組織中高表達，陽性率高達100%，在正常膀胱組織中低表達，陽性率37.5%，兩者比較差異有統計學意義，其表達含量在不同臨床分期、臨床分級、初次和復發之間比較差異均有統計學意義，用定量的方法進一步證實UCA1在膀胱癌的診斷以及判斷進展和預后情況方面具有重要意義，可為臨床治療提供重要依據。

至今UCA1在胚胎形成中的作用以及在膀胱癌發生發展和復發過程中的作用機制尚不明確，它在膀胱癌治療方面能否成為基因靶向治療的一個新的靶點，有待進一步研究。

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(收稿日期:2009-11-02)