酶聯(lián)免疫技術(shù)在食品安全與藥物殘留中的應(yīng)用

何方洋　羅曉琴　李　靜

摘要酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)是將抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合發(fā)展建立的一種免疫分析技術(shù)。不僅具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn),而且準(zhǔn)確性好、特異性強(qiáng)、檢測(cè)成本低,還可用于大批量樣品的檢測(cè)。從藥物殘留、生物毒素、微生物以及轉(zhuǎn)基因食品安全性等方面,對(duì)該技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述,并提出了存在的問(wèn)題及相應(yīng)的解決辦法。

關(guān)鍵詞酶聯(lián)免疫吸附法;食品安全;藥物殘留;應(yīng)用

中圖分類號(hào) TS201.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)15-0353-02

食品安全問(wèn)題是關(guān)系到人體健康和國(guó)計(jì)民生的重大問(wèn)題,作為WTO的新成員,我國(guó)與世界各國(guó)間的貿(mào)易往來(lái)日益增加,食品安全已經(jīng)成為影響農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵因素,并在某種程度上制約了我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和食品工業(yè)的戰(zhàn)略性調(diào)整。目前,全球食品安全形勢(shì)不容樂(lè)觀,主要表現(xiàn)為食源性疾病、惡性食品污染不斷上升和部分食品生產(chǎn)加工新技術(shù)與新工藝帶來(lái)新的危害,給人體健康帶來(lái)了長(zhǎng)期和嚴(yán)重的潛在健康危害。但對(duì)于目前一些公認(rèn)的重要食源性危害,在檢測(cè)技術(shù)方面,不少尚屬空白或不夠完善,不能滿足食品安全控制的需要。因此,建立一項(xiàng)高技術(shù)化、系列化、速測(cè)化、便攜化的檢測(cè)方法顯得特別重要。酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定技術(shù),即ELISA,因其操作程序的規(guī)范化、簡(jiǎn)單化和檢測(cè)的高靈敏性,在食品安全與藥物殘留等的安全性檢測(cè)領(lǐng)域中有著廣泛的發(fā)展前景。

1酶聯(lián)免疫分析法概述

1.1基本原理

酶聯(lián)免疫分析法的基本原理是把抗原或抗體預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面;測(cè)定時(shí),將受檢樣品(含待測(cè)抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原或抗體復(fù)合物;反應(yīng)終止后,固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合量(免疫復(fù)合物)與標(biāo)本中待檢抗體或抗原的量成一定比例;經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì),加入酶反應(yīng)底物后,底物即被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物,最后通過(guò)定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量。

1.2與其他檢測(cè)法相比的優(yōu)勢(shì)

目前用于食品安全檢測(cè)的方法有很多,如薄層色譜(TLC)、微生物法、氣相色譜(GC)、質(zhì)譜(MS)、高效液相色譜(HPLC)和核酸探針技術(shù)等。但這些方法有的必須進(jìn)行較為復(fù)雜的樣品預(yù)處理,有的不能定量且靈敏度低,有的雖靈敏度高,但設(shè)備昂貴,檢測(cè)費(fèi)用高,難以推廣使用。微生物法不易篩選到特別敏感的菌株,也只能定性不能定量,易受其他抗菌藥物的影響;核酸探針則在試驗(yàn)過(guò)程中易受到污染。而酶聯(lián)免疫分析法不僅靈敏度高、干擾小、安全性高、污染少、檢測(cè)通量大,且操作簡(jiǎn)便快捷。

2ELISA技術(shù)在食品安全性檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1農(nóng)藥殘留檢測(cè)

近年來(lái)濫用農(nóng)藥現(xiàn)象使農(nóng)藥殘留量超標(biāo)相當(dāng)嚴(yán)重,并逐年加劇。傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法如氣相色譜法和高效液相色譜法能精確地檢測(cè)殘留的農(nóng)藥量,但需要昂貴的儀器設(shè)備、復(fù)雜的前處理、專業(yè)技術(shù)人員及較長(zhǎng)的分析周期。20世紀(jì)80年代開(kāi)始,農(nóng)藥的免疫檢測(cè)技術(shù)作為快速篩選檢測(cè)方法得到了快速發(fā)展。目前幾乎所有農(nóng)藥類別都建立了酶聯(lián)免疫分析方法,檢測(cè)樣本以農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料和環(huán)境為主。歐洲、美國(guó)、日本、巴西等多個(gè)國(guó)家應(yīng)用該技術(shù)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中有毒物質(zhì)殘留進(jìn)行生物技術(shù)監(jiān)測(cè)研究,粗篩檢測(cè)水產(chǎn)品、肉類產(chǎn)品和果蔬產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量。最近,英國(guó)研制的通用型有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑免疫檢測(cè)試劑盒可同時(shí)檢測(cè)8種以上的有機(jī)磷農(nóng)藥[1]。我國(guó)在近10年來(lái)也相繼開(kāi)展了農(nóng)藥殘留酶免疫法快速檢測(cè)方法的研究,取得了一定的研究成果,如山東京蓬生物藥業(yè)公司在乙酰膽堿酯酶基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)研制的快速檢測(cè)試紙,對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測(cè)快速而準(zhǔn)確,敏感度0.01～5.00mg/kg,準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。

2.2動(dòng)物性食品中藥物殘留檢測(cè)

近年來(lái)動(dòng)物性食品藥物殘留問(wèn)題更加突出。目前,國(guó)內(nèi)應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)藥物殘留研究取得較大進(jìn)展。王伊琴等[2]建立了氯霉素殘留檢測(cè)的ELISA方法,靈敏度0.025～2.000ng/mL,檢測(cè)限0.02μg/kg,回收率達(dá)78.2%。王自良等[3]研制的苯巴比妥ELISA試劑盒,線性檢測(cè)范圍達(dá)1.0~81.0ng/mL,靈敏度0.75ng/mL,檢測(cè)限1ng/mL,在飼料樣和豬尿樣的平均添加回收率分別為85.8%和91.3%。王選年等[4]研制的鹽酸克倫特羅ELISA試劑盒線性檢測(cè)范圍為0.5~128.0ng/mL,與腎上腺素、去甲腎上腺素、萊克多巴胺及多種抗生素均無(wú)交叉反應(yīng)性,回收率高達(dá)90%以上。

2.3生物毒素的檢測(cè)

Anna Yu Kolosova等[5]運(yùn)用ELISA方法測(cè)黃曲霉毒素B1,檢測(cè)范圍0.1~10.0ng/mL,IC500.62ng/mL,大米樣品中的回收率為94%～113%。近十幾年來(lái)國(guó)內(nèi)用于生物毒素檢測(cè)的ELISA方法得到迅速發(fā)展,已有多種ELISA診斷試劑盒用于分析不同的毒素。湖北省農(nóng)科院研制的黃曲霉毒素ELISA試劑盒,在檢測(cè)食品、飼料中的黃曲霉毒素時(shí),抗原轉(zhuǎn)化率為89.4%,檢測(cè)限3.33ng/mL;王玉平等[6]在抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體基礎(chǔ)上,研制出ELISA定量檢測(cè)試劑盒,靈敏度1 ng/mL,檢測(cè)限10ng/g,該方法也被廣泛應(yīng)用于各種藻類和貝類毒素的檢測(cè)。

2.4微生物的檢測(cè)

食品安全問(wèn)題中,首要問(wèn)題是微生物污染。檢測(cè)微生物的方法很多,常規(guī)的微生物學(xué)檢驗(yàn)方法試劑繁雜、檢驗(yàn)周期長(zhǎng),遠(yuǎn)不能適應(yīng)實(shí)際需要,而ELISA法很好地彌補(bǔ)了這一缺陷。用ELISA法可檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等微生物,其中通過(guò)制備單克隆抗體分析食品中細(xì)菌的ELISA技術(shù)研究最多,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。Lyer MS等[7]用間接ELISA法來(lái)測(cè)食品和飼料中的鐮刀菌,可檢測(cè)出102～103cfu/mL的含量;文其乙等[8]建立了直接ELISA法檢測(cè)沙門(mén)氏菌,能檢出沙門(mén)氏菌屬99個(gè)菌株,最低檢測(cè)量可達(dá)500cfu/g,時(shí)間僅需22h,比常規(guī)方法縮短了3~4d,與其他腸道桿菌不發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.5轉(zhuǎn)基因食品安全性的檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因過(guò)程的每一個(gè)環(huán)境都有可能對(duì)食品的安全性產(chǎn)生影響,因此轉(zhuǎn)基因食品的安全性是最近有關(guān)食品安全性研討的熱點(diǎn)問(wèn)題之一,許多國(guó)家都有嚴(yán)格的法規(guī)來(lái)管理轉(zhuǎn)基因食品。ELISA主要應(yīng)用于原料和半成品的快速定性分析[9],因而解決了轉(zhuǎn)基因樣品檢測(cè)中核酸制備困難的問(wèn)題。Rogan等用ELISA技術(shù)檢測(cè)出傳統(tǒng)大豆加工產(chǎn)品中混有2% Roundup Ready大豆中的CP4 EPSPS蛋白質(zhì)。此方法具有選擇性和靈敏性,具有商業(yè)可利用性。Holzhauser等[10]運(yùn)用ELISA技術(shù)檢測(cè)出各種食物中花生蛋白質(zhì)的最低殘余量為2mg/kg。目前,市場(chǎng)上已有檢測(cè)常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因蛋白的ELISA試劑盒。如Stratejic Dignostics公司已開(kāi)發(fā)能簡(jiǎn)便地定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的試劑盒,其原理就是利用ELISA方法制備出的特異性抗體檢測(cè)Roundup大豆的特異基因產(chǎn)物CP4 EPSPS蛋白。

3ELISA技術(shù)在食品安全性檢測(cè)中的研究展望

酶聯(lián)免疫技術(shù)研究雖然只有短短幾十年,但它可以應(yīng)用到檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域,也為醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用展示了廣闊的前景。國(guó)內(nèi)外有許多家公司制作了大量的ELISA商業(yè)試劑盒。但我國(guó)現(xiàn)行的食品安全檢驗(yàn)還沒(méi)有規(guī)范化,體現(xiàn)在:檢測(cè)方法多借鑒或參照國(guó)外的一些方法,不完整,沒(méi)能形成體系;可比性、可操作性較差;檢測(cè)方法繁瑣、報(bào)告結(jié)果周期長(zhǎng),不適應(yīng)日常大量的生產(chǎn)流通環(huán)節(jié)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的臨控;檢測(cè)靈敏度無(wú)法達(dá)到國(guó)際上現(xiàn)行的、越來(lái)越嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。酶聯(lián)免疫吸附法因其簡(jiǎn)便、快速、靈敏、微量化等諸多的優(yōu)點(diǎn),在建立安全檢驗(yàn)方法方面有很大的應(yīng)用空間。現(xiàn)在,有大量的ELISA 商業(yè)試劑盒,可供作相應(yīng)項(xiàng)目的檢測(cè),但由于食品原料體系的多樣性、復(fù)雜性,ELISA法要成為某一食品安全檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法,并將其推廣應(yīng)用,還有一定距離。在改進(jìn)樣品的純化步驟,提高回收率、靈敏度方面;在減少基底干擾,提高重現(xiàn)性和穩(wěn)定性方面;在簡(jiǎn)化分析程序,降低分析成本方面;在與其他理化分析方法聯(lián)用,克服自身局限性方面;在試劑、操作規(guī)程的標(biāo)準(zhǔn)化等方面有待于進(jìn)一步摸索,還有大量工作要做。目前許多學(xué)者正致力于改進(jìn)完善這種技術(shù),不斷有新的研究成果推出,可以肯定,ELISA在各種產(chǎn)品安全檢測(cè)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

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