凍水產(chǎn)品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢驗研究

摘要對從湛江地區(qū)進(jìn)出口水產(chǎn)品加工廠抽取的1158份凍水產(chǎn)品進(jìn)行的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌分析，本實驗采用了全自動酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法進(jìn)行了初步篩選，對分離菌株用API Listeria 試劑盒進(jìn)行鑒定。經(jīng)檢驗，1158個樣品中有7個樣品(0.60%)為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性，另有4個(0.35%)為 L.innocua， L.welschimeri 和L.grayi 陽性。本試驗Vidas LMO檢測試劑條呈現(xiàn)4個假陽性，經(jīng)鑒定為李斯特氏菌屬中L.innocua，L.welschimeri 和L.grayi，表明Vidas LMO檢測試劑條存在一定的假陽性率。

關(guān)鍵詞凍水產(chǎn)品 檢驗 污染

中圖分類號:R155文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

1 前言

單核細(xì)胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes，L.M)是一種胞內(nèi)寄生菌，可引起人及多種動物致病。對人類而言 ，各年齡組均可感染而發(fā)病，但主要是免疫功能低下者最易受該菌感染，導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥等疾病以及流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等后果。食品，特別是海產(chǎn)品易被該菌污染，病人及無癥狀攜帶者也可成為傳染源。據(jù)國外有關(guān)研究報道，由單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的食物中毒案例已超過沙門氏菌，被 WHO列為二十世紀(jì) 90年代的四大食源性致病菌之一。單核細(xì)胞增生李斯特菌引起的食物中毒發(fā)病高峰在夏季和冬季，發(fā)病率在各地區(qū)之間存在差異，根據(jù)目前的報道，歐美等發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，而亞、非、拉等發(fā)展中國家報道較少，這可能與這些國家的飲食習(xí)慣差異有關(guān)。付萍等于 1996～1997年組織了全國12個省份對國內(nèi)七類食品3746份樣品進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌的污染情況調(diào)查，結(jié)果表明:七類樣品中除了蔬菜外均檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌，其分離率為:冷飲1.39%、生肉1.53%、乳制品0.52%、熟肉制品0.47%、乳0.72%及水產(chǎn)品0.19%。

2 材料與方法

2.1 儀器和試劑

法國生物梅里埃 (Biomerieux)公司 mini-ViDAS全自動熒光酶免疫分析儀;日本尼康(NIKON)生物顯微鏡;上海一恒科技有限公司隔水式恒溫培養(yǎng)箱。Demi-Fraser肉湯，F(xiàn)raser肉湯，PALCAM選擇性培養(yǎng)基，科瑪嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基購自BD公司;VIDAS LMO試劑盒，API Listeria試劑盒購自廣州千江公司。

2.2 樣品來源

采自湛江市各進(jìn)出口水產(chǎn)品加工廠，共1158份樣品，包括凍羅非魚片、凍熟帶頭蝦、凍熟蝦仁、凍熟鳳尾蝦、凍生帶頭蝦和凍去頭蝦6個品種。

2.3 增菌培養(yǎng)

以無菌操作稱取剪碎的水產(chǎn)樣品 25 g，加于 225 ml Demi-Fraser肉湯中， 30℃ 培養(yǎng) 24 小時后，吸取 1 ml培養(yǎng)液于 10 mlFraser肉湯中，置30℃ 24小時進(jìn)行第二次増菌培養(yǎng)。

2.4 分離和鑒定

用VIDAS LMO試條對樣品進(jìn)行初篩:全自動快速免疫檢測儀(mini - VIDAS)的工作原理為酶聯(lián)熒光免疫反應(yīng)。吸取第二次培養(yǎng)物500l注入準(zhǔn)備好的 VIDAS LMO試條，按 START SECTION啟動鍵，待其自動出結(jié)果，陰性即可報告為未檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌;陽性者則按照國標(biāo)法(GB/T 4789.30-2008第一法)進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定，本實驗選擇API Listeria生化鑒定試劑盒對分離菌株進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果與分析

對從1158份VIDAS LMO試條陽性的樣品中分離出來的典型和可疑菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，運動性觀察，動力試驗，過氧化氫酶，氧化酶試驗，溶血試驗和 API Listeria 鑒定試驗。經(jīng)鑒定，在 1158個樣品中，有11個(0.95 %)為李斯特氏菌屬陽性，其中 7個(0.60 %) 為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性。在170個凍羅非魚片樣品中，5個(2.94%)為李斯特氏菌屬陽性，其中4個(2.35%)為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性;在314個凍熟帶頭蝦樣品中，2個(0.64 %) 為李斯特氏菌屬陽性，其中1個(0.32 %) 為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性;在220個凍熟鳳尾蝦樣品中，1個(0.45 %)為李斯特氏菌屬陽性，無單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性;在284個凍熟蝦仁樣品中，3個(1.06 %)為李斯特氏菌屬陽性，其中2個(0.70%)為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性;凍生帶頭蝦和凍去頭蝦樣品均無陽性(見表 1) 。

據(jù)報道，日本人對凍水產(chǎn)品污染單增李斯特氏菌的情況進(jìn)行了調(diào)查，從2℃保存的貨物中抽取100個樣，其中有20(20%)個污染單增李斯特氏菌;從10℃保存的貨物中抽取65個樣品，有12(18.46%)個單增李斯特氏菌陽性。對40個凍水產(chǎn)品加工廠進(jìn)行了單增李斯特氏菌的污染調(diào)查工作，發(fā)現(xiàn)有13(33%)個工廠的產(chǎn)品被單增李斯特氏菌污染;有25(63%)家工廠的車間污水檢出單增李斯特氏菌。調(diào)查數(shù)據(jù)表明，車間污水污染單增李斯特氏菌與凍水產(chǎn)品污染單增李斯特氏菌相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)湛江地區(qū)水產(chǎn)品中單增李斯特氏菌污染率遠(yuǎn)低于這一數(shù)值，這可能與該地區(qū)水產(chǎn)品加工(下轉(zhuǎn)第170頁)(上接第163頁)廠的環(huán)境衛(wèi)生，車間污水處理情況及水產(chǎn)品加工廠在生產(chǎn)加工過程中部分使用了消毒劑等因素有關(guān)。本研究中也發(fā)現(xiàn)凍羅非魚片的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染率高于其它樣品(表1)，這可能是凍羅非魚片在加工過程中與臺面及器具接觸的機會多，增加了交叉污染所引起的。

在被分離出的李斯特氏菌中，除部分被鑒定為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌外，其它為L.i nnocua，L .welschimeri 和L.grayi，而其它李斯特氏菌未分離到。這一結(jié)果與 C. M.Franco 等人的研究報道相似。

本研究中，為了比較全自動酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法和API Listeria生化鑒定法兩種方法，先用VIDAS LMO試條對樣品進(jìn)行初篩，然后對陽性樣品進(jìn)行API Listeria鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1158份樣品中，ViDAS LMO存在4個假陽性，見表2。

表1 1158份不同種類的凍水產(chǎn)品中李斯特氏菌污染率的比較

表2全自動酶聯(lián)熒光免疫分析儀篩選法和API Listeria生化鑒定法兩種方法的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢出率比較

以上結(jié)果表明，在湛江地區(qū)進(jìn)出口水產(chǎn)品加工廠加工的水產(chǎn)品中存在一定比例的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和李斯特氏菌屬的污染，在污染的李斯特氏菌屬中除單核細(xì)胞增生李斯特氏菌外，其它是L.innocua，L.welschimeri 和 L.grayi。

本次實驗結(jié)果與L.M .Graves等報道的“VIDAS系統(tǒng)檢測LMO的敏感性和特異性均為 100 %”的結(jié)論有一定的差異，API鑒定結(jié)果為L.innocua、L.welschimeri和 L.grayi的樣品其VIDAS LMO測定結(jié)果卻呈陽性，筆者認(rèn)為出現(xiàn)假陽性的原因有兩種可能，一是這些菌株與LMO有某些抗原交叉，二是該菌株中存有非特異性物質(zhì)。當(dāng)然，這里面的原因是相當(dāng)復(fù)雜的，有待于進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

[1]Ryser T，Elmer HM.Listeriosis and food safety[J].MarcelDekke Inc，1991，6(2):214～216.

[2]Schlech WF，Lavigne PM，Bortulussi RA.Epidemic Listeriosis:evidence of transmission by food[J].N J Med，1983，308:203～206.

[3]付萍，冉陸，李志剛等 .中國七類食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染狀況研究[J].衛(wèi)生研究，1999，28(2).

[4]GB/T 4789.30 -2008食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗.

[5]張海英等.食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的污染概況及防制.食品研究與開發(fā)，2003，24(6):154～155.

[6]L. M . Graves，P. S. Hayes， B. Swaminathan， R. Johns on， C.Gravens. AMS，(96屆年會) 05. 1996.