酵母雙雜交系統在生命科學中的應用

王改芳

摘要對酵母雙雜交系統原理、組成以及酵母雙雜交在生命科學中的應用進行了綜述，以期為酵母雙雜交系統在生命科學中的應用提供理論依據。

關鍵詞酵母雙雜交系統；生命科學；應用

中圖分類號Q786文獻標識碼A文章編號 1007-5739（2009）04-0259-01

1酵母雙雜交技術的基本原理

酵母雙雜交系統（two-hybrid system）也叫相互作用陷阱（interaction trap），是1989年由Stanley和Song等提出并初步建立的，并于20世紀90年代得到發展。酵母雙雜交系統的建立是基于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。反式轉錄激活因子，例如酵母轉錄因子GAL4，在結構上是組件式（modular）的，往往由2個或2個以上結構上可以分開、功能上相互獨立的結構域（domain）構成，其中有DNA結合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和轉錄激活結構域（acti-vation domain，DNA-AD）。這2個結合域將它們分開時仍分別具有功能，但不能激活轉錄，只有當被分開的二者通過適當的途徑在空間上較為接近時，才能重新呈現完整的GAL4轉錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。

2酵母雙雜交系統的組成

一個酵母雙雜交系統包括3個部分：帶有1個或多個攝制報告基因的宿主菌株；與GAL4-BD融合表達蛋白，被表達的蛋白稱為旅館誘餌蛋白（bait）；GAL4-AD融合表達載體，被表達的蛋白稱為靶蛋白（prey）。為了防止釀酒酵母內源性的GAL4的影響，人們將該基因誤敲除掉，發展成雙雜交宿主菌株。常用的缺陷型酵母菌株有SFY526和HF7c，帶有特定的報告基因lacZ 、his3和leu2等，但喪失表達內源GAL4轉錄激活因子的能力。所用的質粒載體為能在大腸埃細菌和釀酒酵母中進行復制的穿梭質粒。第1種質粒載體是pGBT9，又叫DNA-BD載體。誘餌蛋白基因是按照正確的取向和讀碼結構被克隆在這個載體的多克隆位點上，于是就在誘餌蛋白GAL4-BD之間產生融合作用，形成雜種蛋白Ⅰ。第2種質粒載體是pGAD424，又叫AD質粒載體，是用來構建欲篩選靶蛋白的cDNA文庫的專用載體。克隆的cDNA片段是按照正確的取向和讀碼結構插入到載體的多克隆位點區內，因此，cDNA編碼的蛋白質便與GAL4-AD產生融合作用，形成雜種蛋白質Ⅱ。這2種雜種蛋白質都能在酵母細胞中得到高水平的表達，而且在核定位序列（nuclear localization sequence）的作用下進入到酵母的細胞核內。pGBT9中的核定位序列是GAL4DNA結合域序列中間的一部分。而在pGAD424載體中，核定位序列是SV40的T抗原序列，被克隆在ADH1啟動子和GAL4激發結構域序列之間。SV40的核定位序列使核內的蛋白量可以滿足檢測的靈敏度需要。

3酵母雙雜交的應用

3.1利用酵母雙雜交發現新的蛋白質和蛋白質的新功能

酵母雙雜交技術已經成為發現新基因的主要途徑。將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進一步克隆得到隨機插入的cDNA片段，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關的主要方法。例如：Engelender等人以神經末端蛋白alpha-synuclein 蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3為操作平臺，從成人腦cDNA文庫中發現了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并證明了Synphilin-1與alpha-synuclein 之間的相互作用與帕金森病的發病密切相關。為了研究2個蛋白之間相互作用的結合位點，找到影響或抑制2個蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母雙雜交技術和基因修飾證明了alpha-synuclein的1~65個氨基酸殘基和Synphilin-1的349~555個氨基酸殘基之間是相互作用的位點。研究它們之間的相互作用位點有利于基因治療藥物的開發。

3.2利用酵母雙雜交在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用

酶聯免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技術都是利用抗原和抗體間的免疫反應，研究抗原和抗體之間的相互作用，但是它們都是基于體外非細胞的環境研究蛋白質與蛋白質的相互作用。而在細胞體內的抗原和抗體的聚積反應則可以通過酵母雙雜交進行檢測。例如：來源于矮牽牛的黃烷酮醇還原酶DFR與其抗體scFv的反應中，抗體單鏈的3個可變區A4、G4、H3與抗原之間作用有強弱的差異。Geert等利用酵母雙雜交技術，將DFR作為誘餌蛋白，編碼抗體的3個可變區的基因分別被克隆在AD-LIBRARY載體上，將BD-BAIT載體和每種AD-LIBRARY載體分別轉化到改造后的酵母菌株中，并檢測報告基因在克隆的菌落中的表達活性，從而在活細胞的水平上檢測抗原和抗體的免疫反應。

3.3利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質之間相互作用的影響

酵母雙雜交的報告基因能否表達在于誘餌蛋白與靶蛋白之間的相互作用。對于能夠引發疾病反應的蛋白互作可以采取藥物干擾的方法，阻止它們的相互作用以達到治療疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黃熱病、肝炎等疾病，研究發現它的病毒RNA復制與依賴于RNA的RNA聚合酶（NS5）和拓撲異構酶NS3，以及細胞核轉運受體BETA-importin的相互作用有關。研究人員通過酵母雙雜交技術找到了這些蛋白之間相互作用的氨基酸序列。如果能找到相應的基因藥物阻斷這些蛋白之間的相互作用，就可以阻止RNA病毒的復制，從而達到治療這種疾病的目的。

3.4利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖（Genome Protein Linkage Map）

眾多的蛋白質在許多重要的生命活動中都是彼此協調和控制的。基因組中的編碼蛋白質的基因之間存在著功能上的聯系。通過基因組的測序和序列分析發現了很多新的基因和EST序列。HUA等人利用酵母雙雜交技術，以所有已知基因和EST序列為誘餌，在表達文庫中篩選與誘餌相互作用的蛋白，從而找到基因之間的聯系，建立基因組蛋白連鎖圖。對于認識一些重要的生命活動，如信號傳導、代謝途徑等有重要意義。

4參考文獻

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