神術散方不同提取物體內抗甲型流感病毒作用的研究

（1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210046；2.江蘇省方劑研究重點實驗室，江蘇南京210046；

3.南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇南京210029）

摘要：目的：觀察神術散方中不同提取物抗甲型流感病毒的作用。方法：以甲型流感病毒(A/PR8/34)滴鼻感染小鼠，以利巴韋林作為陽性對照藥，觀察神術散方中不同提取物對小鼠病毒致小鼠死亡率等影響。結果：神術散方不同提取物對甲型流感病毒(A/PR8/34)感染小鼠具有不同程度的延長存活的時間作用，其中，羌活去油水提液的保護率為56.3%，加減甘草醇提物神術散方超臨界提取物的保護率分別為50%和43.75%，與病毒模型組比較具有顯著性差異（P<0.05）。而其混合揮發油對甲型流感病毒感染小鼠的保護率沒有統計學意義。結論：神術散不同提取物均具有一定的體內抗流感病毒作用。

關鍵詞：神術散；提取物；抗甲型流感病毒

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2008）10-0030-03

“神術散”方源于宋《楊氏家藏方》卷三^［1］。并收載于宋代官修方書《太平惠民和劑局方》卷之二，它是由蒼術、藁本、白芷、羌活、細辛、川芎、甘草等七味中藥組成的復方，主治四時瘟疫，頭痛項強，發熱憎寒，身體疼痛及傷風鼻塞，聲重，咳嗽頭昏^［2］，為歷代醫家治療瘟病犯衛的經典方。為傳承經典醫方，研制防治流行性感冒現代中藥成方制劑，本實驗以甲型流感病毒滴鼻感染小鼠，觀察神術散及其組成藥味的不同提取物對甲型流感病毒感染小鼠的保護作用。

1儀器與試劑

1.1儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設備廠），孵箱（上海分析儀器廠），FA1004電子分析天平（上海天平廠）。

1.2藥材

蒼術為菊科植物北蒼術Atractylodeschinensis(DC)Koidz.的干燥根莖，購自內蒙通遼；白芷為傘形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.exHoffm)Benth.etHook.f干燥根，購自四川；藁本為傘形科植物藁本LigusticumsinensisOliv的干燥根莖，購自四川；川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort的干燥根莖，購自四川；細辛為馬兜鈴科植物北細辛AsarumheterotropoidesFr.SChmidtvar.mandshuricum(Maxim)Kitag.干燥根及根莖，購自遼寧遼中；羌活為傘形科植物羌活NotopterygiumincisumTingexH.T.Chang的干燥根莖及根，購自四川資陽；甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch的干燥根及根莖，購自甘肅。以上藥材均經南京中醫藥大學中藥鑒定學教研室王春根教授鑒定。

1.3試劑

乙醚（南京試劑廠批號050107）；雞紅細胞（新鮮公雞血，用生理鹽水洗滌后備用）；氯化鈉（太倉化工廠批號050722）；苦味酸（上海化學試劑藥品供應站批號040221）；雞膽（9~11日齡，南京中牧股份藥械廠）。

1.4陽性對照

利巴韋林片（四川美大康藥業股份有限公司，批號051101）。

1.5實驗用病毒

甲型流感病毒A/PR8/34（H1N1），由中國預防醫學實驗室病毒研究所提供。

1.6實驗動物

ICR小鼠(由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證：蘇動質97003)，隨機分組，分籠飼養，自由飲水，喂全價顆粒飼料，室溫22±2℃，濕度55%~65%。

2實驗方法

2.1供試液的制備

2.1.1揮發油溶液的制備（I組~II組）

（1）混合揮發油（1）（I）：取蒼術、白芷、川芎、藁本、羌活、細辛（過20目篩）按比例混合，共100g，按照《中國藥典》2005年版一部附錄XD揮發油測定法提取7h，提取后得到揮發油，用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g的混懸液。

（2）混合揮發油（2）（II）：蒼術、白芷、川芎、藁本、羌活、細辛（過20目篩）各50g，按照《中國藥典》2005年版一部附錄XD揮發油測定法分別提取7h，提得的揮發油按比例混合，再用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

2.1.2油水混合液的制備（III組~V組）

（1）油水混合液（1）（III）：將混合揮發油組II與六味藥材的水提混合液（取各藥材提取揮發油后的水煎液，離心，取上清液，按比例混合，濃縮）混合，用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

（2）油水混合液（2）（IV）：將混合揮發油組II與六味藥材混合水提液（取混合藥材提取揮發油后的水煎液，離心，取上清液，濃縮）混合，用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

（3）油水混合液（3）（V）：將混合揮發油組I與六味藥材混合水提液混合，用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

2.1.3水提液的制備（VI組~XI組）

（1）白芷去油水提液（VI）：除去揮發油的白芷水煎液，過濾，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥012g混懸液。

（2）川芎去油水提液（VII）：除去揮發油的川芎水煎液，過濾，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥012g混懸液。

（3）細辛去油水提液VIII：除去揮發油的細辛水煎液，過濾，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥012g混懸液。

（4）羌活去油水提液（IX）：除去揮發油的羌活水煎液，過濾，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥012g混懸液。

（5）蒼術醇提藥渣水提液（X）：取蒼術藥材80%醇提后的殘渣，加8倍量水回流提取3次，每次2h，離心，合并上清液，濃縮。濃縮液用5‰CNC-Na配制成每1mL含藥材0.034g的混懸液。

（6）藁本醇提藥渣水提液（XI）：取藁本藥材80%醇提后的殘渣，加8倍量水回流提取3次，每次2h，離心，合并上清液，濃縮。濃縮液用5‰CNC-Na配制成每1mL含藥材0.034g的混懸液。

2.1.4醇提液的制備（XII組~XVII組）

（1）白芷藥渣醇提液（XII）：取去揮發油白芷的藥渣加80%的乙醇提取3次，每次2h，合并醇提液，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.12g混懸液。

（2）川芎藥渣醇提液（XIII）：取去揮發油川芎的藥渣加80%的乙醇提取3次，每次2h，合并醇提液，合并醇提液，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.12g混懸液。

（3）細辛藥渣醇提液（XIV）：取去揮發油細辛的藥渣加80%的乙醇，提取3次，每次2h，合并醇提液，濃縮成每1mL含生藥0.12g混懸液。

（4）羌活藥渣醇提液（XV）：取去揮發油羌活的藥渣加80%的乙醇提取3次，每次2h，合并醇提液，合并醇提液，濃縮，濃縮液用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.12g混懸液。

（5）蒼術藥材醇提液（XVI）：取蒼術粉末（過20目篩）30g，用80%乙醇溶液在80℃水浴上回流提取3次，每次2h，合并濾液，濃縮。濃縮液用CNC-Na配制成每1mL含藥材0.034g的混懸液。

（6）藁本藥材醇提液（XVII）：取藁本粉末（過20目篩）30g，用80%乙醇溶液在80℃水浴上回流提取提取3次，每次2h，合并濾液，濃縮。濃縮液用CNC-Na配制成每1mL含藥材0.034g的混懸液。

2.1.5超臨界提取液的制備（XVIII組~XIX組）

（1）超臨界提取液（1）（XVIII）：將蒼術、川芎、白芷、細辛、藁本、羌活六味藥材粉末（過20目篩）按處方比例混合，共200g，以95%乙醇為夾帶劑，在萃取壓力25MPa，萃取溫度45℃，分離Ⅰ溫度為40℃，分離Ⅱ溫度為35℃條件下，萃取4h，提取物用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.4g混懸液。

（2）超臨界提取液（2）（XIX）：將上述六味藥材混合超臨界提取物，按處方比例加甘草80%醇提取物（80℃水浴上回流提取，固液比為1∶8，分3次提取，每次2h，合并濾液，濾液濃縮，即得），用5‰CNC-Na配成每1mL含生藥0.44g混懸液。

2.2甲型流感病毒雞胚增毒實驗

取9日齡雞胚，參照雞蛋上標記氣室，放置于無菌凈化臺內，用75%乙醇和2%碘酊分別消毒2次，用無菌砂輪輕輕于氣室隔膜處磨一小口，約0.05cm直徑大小（針尖大小）。取甲型流感病毒（粉狀），分次加入生理鹽水0.3mL，混勻后，吸出至無菌試管內，稀釋至2mL，吹打后，每只雞胚接種0.2mL甲型流感病毒液，置37℃恒溫箱孵養72h。以上9日齡雞胚培養72h后，放入4℃冰箱，使血管內血液凝固，次日取出，置超凈臺內，用75%乙醇和2%碘酊分別消毒后，用無菌鑷子除去封口處石蠟，用鑷子除去氣室及隔膜層，用無菌吸管輕輕吸去尿囊液（棄去渾濁尿囊液），以上收集為增毒一次的尿囊液，以上實驗重復3次后，用于實驗，實驗前做血凝實驗。

2.3血凝試驗

取24孔板，每孔加入生理鹽水0.5mL（除第1孔加入生理鹽水0.9mL），將尿囊液編號（以每只雞胚），取尿囊液0.1mL加入第1管內，混合后取出0.5mL加入第2管依次稀釋至第8管，第9管不加病毒，作空白對照（生理鹽水），隨后，取新鮮公雞血，用生理鹽水洗滌3次后，配成0.5%雞紅細胞生理鹽水溶液，加入0.25mL輕輕搖勻后，置室溫放置2h后觀察記錄。血凝試驗（HA）為640以上用于體內感染小鼠。

2.4甲型流感病毒感染小鼠半數死亡（LD50）滴定

取ICR小鼠56只，體重13~16g，雌雄各半，隨機分7組，每組8只，取增毒3次的病毒尿囊液，以10倍稀釋，每組滴一個病毒濃度，各組小鼠在乙醚淺麻醉下以血凝滴度為640病毒尿囊液50μL滴鼻感染小鼠，觀察14d內死亡數，按Reed-Muench法計算，結果甲型流感病毒的LD50為10-1.71（表1）。

2.5對甲型流感病毒感染小鼠死亡的保護實驗

取ICR小鼠288只，體重13~16g，雌雄各半，隨機分18組，每組16只（見表1）。空白對照組：等量生理鹽水10mL#8226;kg-1；病毒對照組：等量生理鹽水10mL#8226;kg-1；利巴韋林組：50mg#8226;kg-1；藥物組分組及劑量見表1。以上各組動物均灌胃給藥，給藥劑量10mL#8226;kg-1，1次/d×5d，于給藥次日，各組小鼠在乙醚淺麻醉下，以血凝滴度640以上的尿囊液給小鼠滴鼻感染，每鼠50mL，觀察動物感染后發病情況及死亡數目，記錄14d死亡數，并進行組內比較存活天數和存活率。

3結果與討論

（1）神術散提取物對甲型流感病毒（A/PR8/34）感染小鼠死亡的保護的實驗結果見表2。表2神術散提取物對甲型流感病毒（A/PR8/34）感染小鼠死亡的保護作用

（2）由表2可見，神術散方不同提取物有不同程度的減少甲型流感病毒(A/PR8/34)感染小鼠死亡數，延長甲型流感病毒感染小鼠存活天數，除I、II、V、X無統計學意義外，其余各組與病毒模型組比較均有顯著性差異（P<0.05）。提示神術散方對甲型流感病毒具有保護作用。方中單味藥以IX組羌活去油水提液作用最為顯著，保護率為56.3%。

（3）本實驗表明，神術散方中抗病毒藥效物質呈多部位和多成分性，組成藥味具有較好的互補性，醇溶性明顯好于揮發油，方中各單味藥的醇提液均明顯減少甲型流感病毒感染小鼠死亡數，保護率介于43.75%~50%之間。提示原方不用湯劑而以散劑入藥有其科學合理性。（4）超臨界CO²萃取法為復方有效成分提取的新方法。由于其萃取溫度低，尤其適合受熱易氧化分解成分的萃取。本實驗表明加減甘草醇提物神術散方超臨界提取液具有延長甲型流感病毒感染小鼠存活天數，其保護率分別為50%和43.75%。而混合揮發油和油水混合液的保護率均大大低于超臨界提取液，提示超臨界CO²萃取法對抗病毒成分具有很好的溶解性，其揮發油成分基本沒有破壞，是神術散方精制的首選方法。

參考文獻：

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（責任編輯：陳涌濤）