愈肝顆粒對(duì)大鼠肝癌的抵制作用及其表觀遺傳學(xué)機(jī)制

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州646000）

摘要：目的：觀察愈肝顆粒對(duì)大鼠肝癌模型的防治作用，并進(jìn)一步探討其表觀遺傳學(xué)機(jī)制。方法：采用甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR，MSP)技術(shù)檢測(cè)大鼠肝組織p16抑癌基因異常甲基化情況，RT-PCR法檢測(cè)3種主要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）水平變化，ELISA法檢測(cè)血清AFP水平，HE染色觀察肝臟病理情況。結(jié)果：HE染色顯示愈肝顆粒組大鼠肝臟病理改變較輕，細(xì)胞異形性不明顯，而模型對(duì)照組大鼠肝臟細(xì)胞異形性明顯，癌細(xì)胞排列呈梁狀或多板狀或?qū)嵭猿善帕小＝Y(jié)論：愈肝顆?？蓪?duì)大鼠肝癌的發(fā)生有防治作用，其機(jī)制與調(diào)節(jié)DNMTs表達(dá)水平及調(diào)整p16抑癌基因基因啟動(dòng)子甲基化水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞：愈肝顆粒；大鼠；肝癌；二乙基亞硝胺；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；p16基因；甲基化

中圖分類號(hào)：R735.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2008）10-0026-02

原發(fā)性肝癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。盡管近年來(lái)肝癌在診治有很大進(jìn)展，但其預(yù)后仍不樂(lè)觀，因此采取預(yù)防措施降低其發(fā)生顯得尤為重要。中藥在防治肝癌方面有廣闊的前景。本課題旨在通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，制造肝癌模型，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)觀察愈肝顆粒對(duì)DNMTs、p16抑癌基因基因啟動(dòng)子甲基化水平的影響，探索愈肝顆粒防治肝癌的作用機(jī)理，為臨床防治肝癌提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與儀器

RNA抽提試劑盒（Trizol試劑盒）及DNA抽提試劑盒均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；大鼠p16基因甲基化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；RT試劑盒購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖凝膠購(gòu)自西班牙DIOWEST公司；DNAMarker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；大鼠（rat）甲胎蛋白（AFP）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ADL公司；二乙基亞硝胺（DEN）購(gòu)自sigma公司，愈肝顆粒浸膏由瀘州市中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，主要成分由茵陳、梔子、黨參、黃芪、白術(shù)、青皮、丹參、澤蘭、茜草等13味中藥組成，SD大鼠由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制作及分組

選用標(biāo)準(zhǔn)清潔級(jí)SD大鼠70只，體重180±30g，將其隨機(jī)分至3組，空白對(duì)照組10只，模型對(duì)照組30只，愈肝顆粒組30只，每組均為雌雄各半。模型對(duì)照組、愈肝顆粒組大鼠腹腔注射40mg/kg體重的DEN，2次/周，連續(xù)8周?？瞻讓?duì)照組則注射等體積的生理鹽水。同時(shí)，自實(shí)驗(yàn)開(kāi)始愈肝顆粒組大鼠給予愈肝顆粒浸膏（每毫升相當(dāng)于原生藥1.86g）灌胃，10mL/kg體重，每天一次，連續(xù)8周。模型對(duì)照組、空白對(duì)照組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，8周末處死動(dòng)物，留取標(biāo)本。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)

采用Trizol法提取肝組織RNA，NanoDorpND-1000核酸蛋白測(cè)定儀定量，-70℃冰箱保存。每個(gè)樣本設(shè)40μL反應(yīng)體積，將2μｇ總RNA為底物及2μL隨機(jī)引物、2μL逆轉(zhuǎn)錄酶、4μLdNTPs、1μLRNaseInhibitor42℃反應(yīng)20min，cDNA于-20℃冰箱保存。以各樣本cDNA5μL為模板，引物對(duì)按前向、反向順序排列為：DNMT1：5′-CTGAGGAAGGCTACCTGGCTAA-3′，5-TGTCCGACTTGCTCCTCCTG-3′，擴(kuò)增片段204bp，DNMT3A：5′-GGAATGTGCCAGAACTGTAAGA-3′，5′-CCTGTAGCAATCCCATCAAA-3′，擴(kuò)增片段404bp，DNMT3B：5′-TGGTGAAGCGGATGATGGAGATGGC-3′，5′-CCGATGGCGTACTGCTGCTCTTAGG-3′，擴(kuò)增片段329bp，GAPDH：5′-AAATCCCATCACCATCTTCC-3′，5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′，擴(kuò)增片段581bp。

PCR反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后原液2.5μL，Primer1(10μM)1μL，Primer2(10μM)1μL，2×MasterMix12.5μL，反應(yīng)體積25μL。反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置：94℃3min；94℃30sec，TM℃30sec，72℃1min，30循環(huán)；72℃延伸5min。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehydephosphate

dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照。2%-3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析以目的基因條帶與內(nèi)參照GAPDH基因條帶吸光度值進(jìn)行比較，計(jì)算其比值，并對(duì)實(shí)驗(yàn)分組中各樣本計(jì)算結(jié)果取均值(見(jiàn)表1)。

表1各組大鼠肝組織中MSP與DNMTs的表達(dá)情況

（±s）

注：★與空白對(duì)照組比較，P<0.01；△模型對(duì)照組內(nèi)比較，P<0.05；□模型對(duì)照組內(nèi)比較，P<0.01；◇愈肝顆粒組內(nèi)比較，P<0.05；與模型組比較，P<0.01。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析，規(guī)定P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1HE染色光鏡下觀察結(jié)果（見(jiàn)圖1-6）

空白對(duì)照組(圖1，2)：肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，大小均一，細(xì)胞核大而圓，胞質(zhì)豐富。模型對(duì)照組（圖3，4）：癌細(xì)胞排列呈梁狀、索狀或不規(guī)則。愈肝顆粒組（圖5，6）：細(xì)胞排列基本規(guī)則，異形性不明顯。

2.2p16基因異常甲基化

24例模型對(duì)照組大鼠肝臟標(biāo)本經(jīng)MSP法檢測(cè)，18例p16基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化（18/24），26例愈肝顆粒組大鼠肝臟標(biāo)本MSP檢測(cè)，p16基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化（16/26），而10例空白對(duì)照組大鼠肝組織檢測(cè)均為陰性（圖7）（備注：造模死亡10只大鼠）。

圖7p16基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化MSP檢測(cè)結(jié)果

2.3DNNMTs半定量結(jié)果

采用優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件，對(duì)各個(gè)樣本cDNA以特定引物（DNNMTs）及內(nèi)參照GAPDH引物進(jìn)行擴(kuò)增，表1顯示為半定量結(jié)果。

3討論

本研究結(jié)果顯示：24例模型對(duì)照組大鼠肝臟標(biāo)本經(jīng)MSP法檢測(cè)，18例p16基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化（18/24），26例愈肝顆粒組大鼠肝臟標(biāo)本MSP檢測(cè)，p16基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化（16/26），而10例空白對(duì)照組大鼠肝組織檢測(cè)均為陰性，說(shuō)明p16基因的失活在肝癌的發(fā)生中有重要的意義，同時(shí)也表明愈肝顆?？赡芡ㄟ^(guò)抑制DNA的甲基化作用防治肝癌。模型對(duì)照組和愈肝顆粒組大鼠肝組織DNMTs水平檢測(cè)結(jié)果與空白對(duì)照組比較，p16基因異常甲基化陽(yáng)性組DNMT3A、DNMT3B升高較明顯而DNMT1則相對(duì)下降，表明DNMT3A、DNMT3B在促進(jìn)p16基因異常甲基化過(guò)程中起主要作用，同時(shí)表明3種DNMTs相對(duì)水平改變及相互作用與此進(jìn)程關(guān)系密切；與Kimura等在腎透明細(xì)胞癌中的研究結(jié)果不同的是，DNMT1在MSP陰性的肝癌組織中高于正對(duì)照組并略高于異常甲基化陽(yáng)性組。檢測(cè)26例愈肝顆粒組與24例模型對(duì)照組大鼠肝組織DNMT1、DNMT3A、DNMT3B水平，結(jié)果顯示：前者三項(xiàng)水平均較后者低，差異明顯，均P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明愈肝顆粒可能通過(guò)調(diào)節(jié)DNMTs表達(dá)水平調(diào)整DNA甲基化狀態(tài)，從而起到防治肝癌作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示中藥愈肝顆粒可影響肝癌大鼠DNA甲基轉(zhuǎn)移酶水平及p16基因的表達(dá)，為中西醫(yī)結(jié)合治療肝癌提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］王寶恩，張定鳳主編.現(xiàn)代肝臟病學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2003：852-855.

［2］MetzgerE，WissmannM，YinN，MtdlerJM，SchneiderR，PetersAH．eta1．ISD1demethylatesrepressivehistonemarkstopromoteandrogen-receptor-dependenttranscription［J］.Nature，2005，437：436-9.

（責(zé)任編輯：王尚勇）