羊棲菜多糖（ＳＰＦＳ－Ｂ１）的原子力顯微鏡觀察

（1.哈爾濱商業大學 生命科學與環境科學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；

2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076）

摘 要：將提取的羊棲菜多糖Sevage法除蛋白、H2O2脫色后得到羊棲菜多糖半純品，依次通過DEAE-52、Sephadex G-200柱層析分離純化后得到SFPS-B1。用原子力顯微鏡（AFM）對羊棲菜多糖（SPFS-B1）的微觀結構進行觀察。羊棲菜多糖（SPFS-B1）分子的稀溶液鋪展在新鮮解理Ni2＋處理的云母片上，經干燥，乙醇固定后，獲得穩定、重復的圖像。羊棲菜多糖（SPFS-B1）分子具有高度分枝的結構，并且糖鏈間形成環狀、柱狀或近似于螺旋狀的結構。羊棲菜多糖（SPFS-B1）鏈呈多股緊密的螺旋結構，這種現象可能與該多糖中分子間的Van der Waals相互作用以及糖鏈間氫鍵締合有關。

關鍵詞：原子力顯微鏡；羊棲菜多糖；螺旋結構

中圖分類號：R915；R917文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2008）10-0012-02

生命中的螺旋結構現象可能具有普遍性，除蛋白質、核酸、脂類等生物分子都存在螺旋結構外^［1，2］，多糖的螺旋狀結構也有報道^［3，4］，但羊棲菜多糖是否也存在螺旋狀結構至今尚未見報道。由于多糖相對分子質量較大，結構復雜，自身常存在結構缺陷，從而難以得到良好的晶形，原子力顯微鏡（Atomic Force Microscope，AFM）的出現，使得對多糖這樣的生物大分子表面形貌的觀察成為可能^［5，6］。我們用AFM直接觀察羊棲菜多糖的微觀結構，獲得了較清晰、重復性好的分子鏈結構影像，這為深入研究生物組織的微觀結構和揭示生命規律，提供了重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DEAE-52（Pharmacia），Sephadex G-200（Pharmacia），羊棲菜購自哈爾濱市藥材公司，并經哈爾濱師范大學生物系鑒定。

Adventurer萬分之一電子天平（OHAUS公司），旋渦混合器（美國BohemiaNY公司），AJ-Ⅲ型原子力顯微鏡（愛建納米）。

1.2 羊棲菜多糖的分離純化

取一定量的羊棲菜多糖配制成一定質量濃度的多糖水溶液，加入氯仿、正丁醇（5：1），劇烈震蕩20min，混勻，離心（10min，3000r）。除去水相與有機相間的蛋白，水相仍按照此方法反復除蛋白6次后，氨水調節pH值8~9，加入10%左右的H2O2放入冰箱保鮮層過夜，流水透析72h，蒸餾水透析24h，減壓濃縮后，加入4倍體積的無水乙醇，充分震搖于4℃靜置24h，棄上清，沉淀以無水乙醇、丙酮洗滌，備用。

1.3 DEAE-52纖維素柱層析

所得羊棲菜多糖進行DEAE-52（2.6×55cm）柱層析，用0.05mol/LNaCl洗脫，自動部分收集器收集洗脫液，苯酚硫酸法隔管檢測，流水透析至無Cl^-后，冷凍干燥得SFPS-B。

1.4 Sephadex G-200凝膠過濾柱層析

取SFPS-B分別溶于少量水中，進行Sephadex G-200（1.6×80cm）柱層析，以0.02mol/L的NaCl洗脫，自動部分收集器收集洗脫液，苯酚硫酸法隔管檢測，合并單一峰，分別得到SPFS-B1、SFPS-B2部分。將SFPS-B1、SFPS-B2流水透析至無Cl^-后冷凍干燥。得洗脫部分SFPS-B1，本研究對SFPS-B1進行AFM觀察。

1.5 AFM制樣

把SFPS-B1（1mg/mL）溶于去離子蒸餾水中，冷至室溫，再稀釋，加熱溶解，冷卻，直至樣品濃度為0.01mg/mL。通過加熱使樣品溶解完全且減少大聚集體的存在，取5μL多糖溶液（0.01mg/mL）滴在新鮮解理的云母片上，空氣中干燥10min，大量水沖洗去沒有吸附的殘留物，再滴加無水乙醇固定，為防止多糖從云母表面脫附，樣片干燥后即可進行AFM測量。

2 實驗結果

2.1 棲菜多糖DEAE-52

纖維素柱層析如圖1所示，樣品洗脫峰為單一對稱峰，流水透析至無Cl^-后，冷凍干燥得SFPS-B。

圖1 NaCl洗脫曲線

2.2 羊棲菜多糖SPFS-B Sephadex G-200凝膠過濾柱層析

如圖2所示，洗脫組分為2個，將SFPS-B1、SFPS-B2流水透析至無Cl^-后冷凍干燥。取洗脫部分SFPS-B1，本研究對SFPS-B1進行AFM觀察。

圖2 SFPS-B Sephadex G200凝膠色譜純化

2.3 羊棲菜多糖SPFS-B1的原子力顯微鏡（AFM）圖

圖3、圖4是SFPS-B1在云母片上的AFM圖像，掃描范圍分別為44μm×44μm，掃描頻率1.02Hz，從圖中可以看出多糖分子鏈出現近似棒狀螺旋結構，糖鏈的密度依賴于其初始濃度及其沉積到云母片表面的量；圖像的對比度依賴于針尖上的作用力，作用力太大易損壞糖鏈，而太小則對比度差，很難得到清晰、穩定的圖像，最佳的作用力大概在3~4nN量級以內。

從圖3和圖4中可以清楚看到多糖分子鏈及其側枝，聚合物鏈分子間相互纏繞，鏈間通過糖單元間不同的鏈接方式衍生出一些棒狀或帶有分支的側鏈結構，具有近似棒狀螺旋結構，且排列緊密，聚合物鏈分子間相互纏繞，單鏈的厚度為7nm左右，長度20nm~0.5μm范圍內，寬度為10nm左右，遠大于單鏈分子的估算值，這是由于有限大小的針尖掃描不同的部位與分子鏈作用，從而導致增寬效應。通常來說，多糖分子鏈大小一般為0.1~1.0nm，我們得到的圖像顯示的盤繞股粗細為10nm左右，說明每股并非圍單個糖鏈便形成多個糖鏈纏繞成股的情況，提示多糖在結構上呈纏繞和螺旋結構。

圖3 SFPS-B1的AFM圖掃描范圍44μm×44μm

圖4 SFPS-B1的AFM圖掃描范圍44μm×44μm

圖5是羊棲菜多糖分子的高分辨圖像，從圖中可明顯觀察到單個的分子鏈及其側枝結構，以及分子內的纏繞和螺旋狀結構，螺圈相互連接成鏈，這些螺旋結構的左旋和右旋，可能和多糖的L型與D型有關，也可能與單糖之間的連接方式有關，尚需進一步研究證實，羊棲菜多糖鏈呈多股緊密的螺旋形排列，這種現象可能是由于該多糖中分子間的Van der Waals相互作用以及所含糖醛酸發生糖鏈間氫鍵締合所致。

圖5 放大圖

3 討論

羊棲菜多糖由于其相對分子質量大、結構復雜、自身常存在結構缺陷，無法得到良好的晶形，對其二級結構以及高級結構的研究比較困難。原子力顯微鏡（AFM）是近年來發展起來的研究多糖高級結構的一個十分有力的工具。蔡林濤等^［7］用AFM掃描觀察蟲草多糖分子鏈呈分枝結構。

馬秀俐等^［8］用AFM觀察到西洋參多糖（PPQ-d）的分子鏈聚集狀態呈多股緊密并行螺旋形排列。羊棲菜SFPS-B1分子間相互纏繞，單鏈的厚度為7nm左右，長度20nm~0.5μm范圍內，寬度為10nm左右，遠大于單鏈分子的估算值，這是由于有限大小的針尖掃描不同的部位與分子鏈作用，從而導致增寬效應。考慮到該多糖化合物的高糖醛酸含量和分子間的van der Waals相互作用，我們認為一個糖鏈上的糖醛酸羧基或羧基負離子上的強電負性氧原子與另一糖鏈上的羥基氫易于形成分子間氫鍵，依次類推，多個糖鏈之間通過Van der Waals引力和氫鍵相互作用纏繞成股，但以上觀察尚難以得知分子間氫鍵的距離，因此無法推算每股螺旋組成糖鏈的數目。

多糖的立體構型是決定多糖生物活性的決定因素之一，對多糖寡糖片段和多糖單鏈的構象以及多糖與綴合物的空間關系的研究具有重要意義。許多科學家認為多糖的高級結構對功能的影響比一級結構重要。但由于多糖結構復雜，目前對于多糖高級結構的研究還較少，至今還沒有一種有效的方法。原子力顯微鏡（AFM）是研究多糖高級結構的一種有效方法，盡管AFM在多糖結構方面的研究報道不多，但用AFM能獲得多糖高級結構穩定、清晰的圖像，AFM的這些特點已經為多糖結構的深入研究提供了極大的方便。將AFM與其它現代表征手段聯用是研究多糖高級結構的發展方向，具有廣泛的應用前景。

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［4］ Rief，M.；Oesterhelt，F.；Heymann，B.Science，1997，275，1295.

［5］ 馬孜，呂百達，肖琦，等.光學薄膜表面形貌的原子力顯微鏡觀察［J］.電子顯微學報，2000，19（5）：701-708.

［6］ 陳德亮，李輝，韓寶善，等.高堿性pH誘導紫膜片層表面結構變化的原子力顯微鏡直接觀測［J］.生物化學與生物物理進展，2003，30（5）：711-714.

［7］ 蔡林濤，李萍，陸祖宏.原子力顯微鏡觀察蟲草多糖分子的結構形貌［J］.電子顯微學報，1999，18（1）：103-105.

［8］ 馬秀俐，白玉白等西洋參多糖（PPQ-d）的原子力顯微鏡觀察 ［J］.吉林大學自然科學學報，2000，1（1）：105-106.

（責任編輯：王尚勇）