不同檢測方法對女性生殖道支原體感染的比較研究

摘 要：目的：探討不同檢測方法對女性生殖道支原體感染檢測上的優缺點。方法：對我院2006年1月～2008年1月就診的320例女性患者的泌尿生殖道分泌物標本采取支原體培養法和熒光定量-聚合酶鏈反應(FQ-PCR)的檢測方法，比較兩種方法的檢測結果。結果：支原體培養法的陽性檢出率為38.1%，FQ-PCR的陽性檢出率為27.5%，兩種方法的檢測結果差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：FQ-PCR解決了目前病原體檢出率低、周期長、特異性差等缺點，且克服了常規PCR技術假陽性率高的缺陷。

關鍵詞：生殖道支原體感染；熒光定量-聚合酶鏈反應；支原體培養

中圖分類號：R518.9文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2008）09-0097-02

支原體引起生殖道感染的發病率近年呈上升趨勢，解脲支原體(Uu)和人型支原體(Mh)是引起泌尿生殖道感染的主要病原體，尤其是Uu。正確檢測是否為支原體感染是診斷性傳播疾病及治療的重要方法之一。本文主要采用兩種方法對我院320例女性患者的泌尿生殖道支原體感染進行了檢測，進一步比較報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2006年1月～2008年1月在我院就診的320例女性患者的泌尿生殖道分泌物標本；年齡16～72歲，平均34.5歲；病程3個月～1年；患者本人或其配偶有非婚性交史，有不同程度的尿道炎或宮頸炎癥狀；患者一周內均未使用過任何抗菌藥物。

1.2 檢測及方法

1.2.1 支原體培養法

試劑由珠海益民生物工程有限公司提供的支原體培養試劑盒。陰道窺器擴張后，用無菌棉拭子插入女性宮頸1～1.5cm，轉動5～10s后，將分泌物或棉拭子浸入支原體培養液中，充分振洗，洗脫樣品，轉種于Uu和Mh藥敏檢測板，滴加礦物油。置37℃恒溫箱培養24～72h，觀察結果。培養液由淡黃色變為紅色，保持澄清透明為支原體生長，為陽性，未變色為陰性，混濁為檢驗失敗。必要時以顯微鏡高倍鏡下鏡檢確定。

1.2.2 FQ-PCR法

儀器采用德國羅氏公司LightCycler熒光PCR儀。試劑盒由中山醫科大學達安基因診斷中心提供。所有試劑均在有效期期內使用。將標本15000r/min轉速下離心10min，棄上清液，加40μL裂解液，旋渦震蕩30s，混勻沉淀物，煮沸5min，離心10000r/min，時間為2min，取4μL上清液，于0.2mL反應管中，分別加入各種FQ-PCR試劑，設置不同濃度的陽性對照和陰性對照，離心數秒后置入脫氧核糖核酸(DNA)擴增儀中反應。經變性、退火、延伸共32個循環結束反應。工作結束儀器自動計算出樣品中DNA的拷貝數，病原體菌量≥103copy/mL定為陽性，結果＜103copy/mL或未能檢出定為陰性。

1.3 統計學方法

使用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

兩種方法的檢測結果差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。支原體培養法陽性例數及分型情況見表2。

3 討論

泌尿生殖道感染是一種較常見的感染性疾病，其主要通過不潔性行為及性亂等方式傳播。支原體是一類介于細菌與病毒之間，能在無活細胞培養基上生長的最小原核細胞型微生物，屬于柔膜體綱，它分布廣泛，種類繁多，顯微鏡下很難看到，目前已被認為是人類生殖道常見且有致病作用的病原體。目前從人類分離的16種支原體中，有5種對人體有致病性，其中Uu、Mh為臨床最常見的人體致病支原體，可引起一系列男女泌尿生殖系統疾病，甚至影響胎兒生長發育^［1］。尤其是Uu感染除了引起非淋菌性尿道(宮頸)炎外，還與慢性前列腺炎、附睪炎、陰道炎、輸卵管炎、盆腔炎、不育不孕、習慣性流產、子宮頸炎等有關^［2］。女性生殖道被支原體感染后癥狀輕微或無癥狀，常被忽視，快速準確地培養Uu和Mh是臨床診斷泌尿生殖道支原體感染的重要方法。

近年來，隨著免疫學、微生物學、分子生物學診斷技術的發展，檢測生殖系統支原體感染已由培養法、快速免疫法、PCR法發展到FQ-PCR法。支原體液體培養基根據Uu及Mh的生長特性，把培養及生物化學反應相結合，Uu分解脲素產氨，Mh分解精氨酸也產氨均可使培養基變堿而變紅色，由于支原體大小僅200nm，且培養基中加入抗生素能有效抑制大多數細菌生長，陽性結果應在48h內變紅色且不渾濁。支原體液體培養法雖然特異性高，但不靈敏，而且培養基來源困難，配制繁瑣，不易長時間保存，培養鑒定步驟較多，培養周期較長。FQ-PCR是一種對病原體DNA進行檢測的新技術，具有較高的靈敏度和特異性，臨床上已廣泛應用。其原理是以常規PCR方法進行體外擴增為基礎，利用Taq酶具有5’-3’外切酶活性，在上下游引物之間添加一條與靶序列特異結合的探針，這條探針的5’-3’端分別標記了熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)，當探針保持完整時，R基團的熒光信號被Q基團所淬滅，一旦探針被切斷，R基團的熒光信號就可以被熒光監測系統檢測出^［3］。近年來，有研究者將常規培養法與FQ-PCR進行了方法學比較^［4］，認為FQ-PCR克服了培養法敏感性低、陽性率低以及費時費力的缺點，是泌尿生殖道支原體感染的病原學診斷較理想的方法。從本次研究結果中可以看出，支原體培養法比FQ-PCR法檢出率更高。培養法不需要特殊設備，技術操作簡單。FQ-PCR法有其優點，是在閉管狀態下進行擴增和產物分析，無需電泳和染色及紫外觀察，極大地減少了擴增產物的污染，很少因擴增產物污染帶來假陽性，同時也避免了有害化學物質對人體的危害^［5］，且報告結果快、敏感性和特異性較高，是一種較好的分子生物學檢測方法。但FQ-PCR的開展需要有特定的條件，不規范的實驗室操作會導致錯誤的結果(假陽性或假陰性)，而且不能區別死菌和活菌，不能作為判斷痊愈的指標。所以FQ-PCR法對于臨床僅有鑒定意義，沒有判斷療效的意義。

綜上所述，FQ-PCR解決了目前病原體檢出率低、周期長、特異性差等缺點，且克服了常規PCR技術假陽性率高的缺陷，但其對臨床僅有鑒定意義，沒有判斷療效的意義，所以我們建議在臨床中對支原體檢測以培養法為主，FQ-PCR和其它方法為輔。

參考文獻：

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［3］ 林壽榕，陳建森，陳靜.熒光PCR法檢測泌尿生殖道沙眼衣原體、解脲支原體感染［J］.寧夏醫學，2003，25（8）：483-484.

［4］ 李燎，鐘桂書，顏丹.解脲支原體3種檢測方法比較研究室［J］.瀘州醫學院學報，2006，29(2)：121-123.

［5］ 鄒先進，羅凱，蔡蘭.實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測解脲支原體感染［J］.中國皮膚性病學，2001，15(3)：183-184.

（責任編輯：姜付平）