阿托伐他汀與阿司匹林聯(lián)用對家兔血小板聚集作用的影響

摘 要：目的：研究阿托伐他汀（atorvastatin，ATV）與阿司匹林（aspirin，ASA）聯(lián)用對花生四烯酸（arachidonic acid，AA）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導(dǎo)的家兔血小板聚集作用的影響。方法：運(yùn)用比濁法原理，經(jīng)TYXN-96型多功能智能血液凝聚儀測定ATV與ASA單用及聯(lián)用對家兔血小板聚集作用的影響。結(jié)果：ATV與ASA均能抑制AA和ADP誘導(dǎo)的離體和在體家兔血小板的聚集，且ATV和ASA聯(lián)合應(yīng)用抑制作用更強(qiáng)。結(jié)論：ATV和ASA聯(lián)用可增強(qiáng)對AA和ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集的抑制作用，提示臨床聯(lián)用這些藥物治療血栓等栓塞性疾病或使用其復(fù)方制劑可能具有更好的效果。

關(guān)鍵詞：阿托伐他汀；阿司匹林；家兔；血小板聚集

中圖分類號：R965.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197（2008）09-0035-03

目前，血脂紊亂、血粘度增高和血栓形成引起的心腦血管阻塞性疾病的發(fā)病率越來越高，研究有效調(diào)血脂和降低血粘度、抑制血小板聚集的藥物非常重要。阿托伐他汀(atorvastatin，ATV)是目前全球銷量最大的調(diào)血脂藥物，據(jù)報(bào)道，其不僅具有調(diào)血脂作用，還可降低血小板聚集因子CD62p、CD63和血小板A顆粒膜蛋白水平，提示可能具有抗血小板聚集作用。阿司匹林(乙酰水楊酸，ASA)是用于臨床達(dá)100余年經(jīng)久不衰的解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗風(fēng)濕、抑制血小板聚集的非甾體抗炎類藥物，也是目前全球使用最多的抗血小板聚集藥^［1］。大量研究表明，ASA具有減少心血管事件（急性心肌梗死、猝死，需緊急行冠脈內(nèi)介入治療）的發(fā)生率^［2］。因其與ATV的作用機(jī)制不同，可能具有協(xié)同抗血小板聚集作用。但至目前未見ASA與ATV聯(lián)用以抗血小板聚集的研究報(bào)道。本篇擬就此作初步探討，為臨床用藥或研制新的復(fù)方制劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 供試動物

健康家兔，雌雄兼用，體重2~3kg，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號：粵實(shí)動證字第2007082號)。

1.2 藥品及試劑

阿司匹林，由德國Bayer Health Care AG生產(chǎn)，批號：BTA5B35/2。阿托伐他汀鈣，由輝瑞公司生產(chǎn)，批號：65837019。二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)系瑞士進(jìn)口分裝，批號：11008A-08。花生四烯酸(arachidonic acid，AA)為Sigma公司產(chǎn)品，批號：066K1218，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 主要儀器

TYXN-96型多功能智能血液凝聚儀，由上海通用機(jī)電技術(shù)研究所生產(chǎn)。80-2型電動離心機(jī)，由金壇市新航玻璃儀器廠生產(chǎn)。AY120型分析天秤，由日本SHIMADZU 公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 血小板血漿制備

離體試驗(yàn)用自動采血針自清醒家兔耳緣靜脈取血，在體試驗(yàn)用自動采血針在3.5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉下通過心臟穿刺取血，取血后直接注入到含有3.28%的枸櫞酸鈉（血液量與枸櫞酸鈉體積比為9∶1）的試管中，在20~25℃條件下以500r·min-1的速轉(zhuǎn)離心5min，即得上層富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP），余下的血漿再以3000r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10min，得上清液即為貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）^［3］。

2.2 血小板聚集抑制率的計(jì)算

血小板聚集抑制率按下式計(jì)算：IR=（CGR－TGR）/CGR×100%；

IR：聚集抑制率(%)；CGR：對照管聚集百分率(%)；TGR：試驗(yàn)管聚集百分率(%)。

2.3 藥物試驗(yàn)

取體重2～3kg的正常家兔，雌雄兼用，在體和離體試驗(yàn)均隨機(jī)均分為生理鹽水（NS）組、ATV組、ASA組及ATV+ASA組，每組8只。

2.3.1 離體試驗(yàn)

分別取生理鹽水(NS)、ATV(60μg·mL-1)、ASA(800μg·mL-1)及ATV與ASA的混合物(含ATV 30μg·mL-1、ASA 400μg·mL-1)各20μL，加入180μL PRP中置于37℃孵育4min。由PPP調(diào)零后，用微量進(jìn)樣器在不同比色杯中分別加入AA和ADP誘導(dǎo)劑11μL(AA的最終濃度為0.35mmol·L-1，ADP最終濃度為2μmol·L-1)，按比濁法用TYXN-96型多功能智能血液凝聚儀測定離體家兔用藥前后血小板5min內(nèi)聚集率，同時(shí)計(jì)算藥物對血小板聚集的抑制率。

2.3.2 在體試驗(yàn)

取上述家兔，分別用生理鹽水(2mL·kg-1)、ATV(2mg·kg-1)、ASA(10mg·kg-1)及ATV(2mg·kg-1)加ASA(10mg·kg-1)灌胃給藥。給藥前及給藥后0.5，1，2，3和4h分別自心臟取血制備PRP與PPP，各取200μL于37℃中孵育4min。再按離體試驗(yàn)方法測定家兔用藥前后AA和ADP誘導(dǎo)的血小板5min內(nèi)聚集率，并計(jì)算藥物對血小板聚集的抑制率。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文所有數(shù)據(jù)均以±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用F檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 ATV和ASA及其聯(lián)用對AA誘導(dǎo)離體家兔血小板聚集的影響

試驗(yàn)顯示ATV、ASA及其聯(lián)用均具有抑制AA誘導(dǎo)的離體家兔血小板聚集的作用，且聯(lián)合應(yīng)用的作用更強(qiáng)，聯(lián)

合應(yīng)用對血小板聚集率的抑制率比單用ATV的提高17.7%，比單用ASA的提高93.5%，其結(jié)果見表1。

表1 ATV和ASA及其聯(lián)用對AA誘導(dǎo)離體家兔血小板聚集的影響±s，n=8

Drugs(μg·mL-1)Plateletaggregation(%)Ihibition rate(%)

NS65.3±3.7－

ATV (6)35.8±5.6**45.2±7.9**

ASA(80)47.4±4.4**27.5±4.2**

ATV-ASA30.6±2.8**53.2±3.2**

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control.

3.2 ATV和ASA及其聯(lián)用對ADP誘導(dǎo)離體家兔血小板聚集的影響

試驗(yàn)顯示ATV、ASA及其聯(lián)用也均能抑制ADP誘導(dǎo)的離體家兔血小板聚集，聯(lián)用對ADP誘導(dǎo)的離體家兔血小板聚集的抑制作用也較單用為強(qiáng)，聯(lián)用對血小板聚集率的抑制率比單用ATV的提高7.3%，比單用ASA的提高9.8%，其結(jié)果見表2。

表2 ATV和ASA及其聯(lián)用對ADP誘導(dǎo)離體家兔血小板聚集的影響

±s，n=8

Drugs(μg·mL-1)Plateletaggregation(%)Ihibition rate(%)

NS70.5±2.2－

ATV (6)33.6±5.4**52.4±6.5**

ASA(80)34.5±5.1**51.2±6.0**

ATV-ASA30.9±4.9**56.2±5.9**

*P＜0.05，**P＜0.01compared with NS.

3.3 ATV和ASA及其聯(lián)用對AA誘導(dǎo)在體家兔血小板聚集的影響

試驗(yàn)顯示，與離體試驗(yàn)結(jié)果類似，ATV、ASA及其聯(lián)用均具有抑制AA誘導(dǎo)的在體家兔血小板聚集的作用，與用藥前比較差異有顯著性意義（P＜0.05～0.01），其中兩藥聯(lián)用抑制血小板聚集的作用比使用任一單獨(dú)藥物要強(qiáng)，其結(jié)果見表3，4。

表3 ATV和ASA及其聯(lián)用對AA誘導(dǎo)在體家兔血小板聚集的影響±s，n=8

drug(mg·kg-1)

Platelet aggregation after administration(%)

0h0.5h1h2h3h4h

ATV(2)65.5±2.464.4±5.2**60.9±3.4**58.1±4.7*52.1±3.2**45.5±3.5**

ASA (10)65.2±3.660.9±4.3**55.3±5.0**45.1±2.8**50.1±4.0*53.1±3.5**

ATV+ASA65.3±4.058.6±3.8**55.0±3.6**50.5±5.2*47.5±3.7**42.0±4.6**

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with 0 hour.

表4 ATV和ASA及其聯(lián)用對AA誘導(dǎo)在體家兔血小板聚集的抑制率±s，n=8

drug (mg·kg-1)

Inhibitive rate of Platelet aggregation(%)

0.5h1h2h3h4h

ATV(2)1.7±4.96.9±3.711.3±6.3*20.3±5.0**30.6±4.4**

ASA (10)6.7±4.415.3±6.130.8±5.1*23.2±2.3**18.6±2.1**

ATV+ASA10.3±4.115.8±3.1**22.8±4.6*27.5±6.3**35.7±5.0**

*P＜0.05， **P＜0.01 compared withATV+ASA.

3.4 ATV和ASA及其聯(lián)用對ADP誘導(dǎo)在體家兔血小板聚集的影響

試驗(yàn)顯示ATV、ASA及其聯(lián)用均能抑制ADP誘導(dǎo)的在體家兔血小板聚集，與用藥前比較差異有顯著性意義（P＜0.05～0.01），其中兩藥聯(lián)用抑制血小板聚集的作用比使用任一單獨(dú)藥物要強(qiáng)，其結(jié)果見表5，6。

表5 ATV和ASA及其聯(lián)用對ADP誘導(dǎo)在體家兔血小板聚集的影響±s，n=8

drug(mg·kg-1)

Platelet aggregation after administration(%)

0h0.5h1h2h3h4h

ATV(2)65.1±3.363.3±4.0**60.5±3.6*57.8±5.4**50.0±3.1**44.8±5.2**

ASA (10)65.2±3.660.0±4.2**54.8±5.3*46.2±2.8**51.1±4.1**54.5±4.1**

ATV+ASA65.5±4.258.2±4.4**54.6±5.7*49.9±3.5**47.0±4.5**42.1±3.6**

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with 0 hour.

表6 ATV和ASA及其聯(lián)用對ADP誘導(dǎo)在體家兔血小板聚集的抑制率±s，n=8

drug(mg·kg-1)

Inhibitive rate of Platelet aggregation(%)

0.5h1h2h3h4h

ATV(2)2.8±2.47.0±4.211.3±6.0*23.2±2.9**31.3±4.8**

ASA (10)8.0±3.416.0±5.9**29.2±3.6**21.6±5.5**16.4±3.9**

ATV+ASA11.2±2.5**16.7±5.2**23.8±4.5**28.3±5.8**35.8±3.6**

*P＜0.05，**P＜0.01 compared withATV+ASA.

4 討論

心腦血管阻塞性疾病的發(fā)病率越來越高，已成為發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。脂質(zhì)代謝紊亂及血小板聚集功能亢進(jìn)在各類血栓形成性疾病中起著重要作用，而調(diào)血脂和降低血粘度、抑制血小板聚集是治療的有效措施，因此研究安全有效的此類藥物非常重要。ASA可使環(huán)氧化酶乙酰化而失活，其對環(huán)氧化酶的抑制作用是不可逆的。血小板上的花生四烯酸在環(huán)氧化酶作用下主要生成TXA2，而血管內(nèi)皮上的花生四烯酸在環(huán)氧化酶作用下主要生成前列環(huán)素(PGI2)。TXA2有強(qiáng)烈的縮血管作用，并且是一種促使血小板激活的因子。PGI2作用正好和TXA2相反。PGI2一方面可使血管擴(kuò)張，另一方面可通過激活腺苷酸環(huán)化酶，使cAMP含量增加，從而對血小板激活有抑制作用^［4］。

ASA問世100多年來，主要用于治療關(guān)節(jié)炎、感冒發(fā)熱和風(fēng)濕病等。1970年前后，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)它具有明顯抑制血小板的凝集作用，能防止血液凝固成血栓。此后，ASA便日益廣泛地應(yīng)用于心腦血管疾病的預(yù)防和治療中，成了當(dāng)今公認(rèn)的抗血小板凝聚防治血栓性疾病的首選藥物，但目前臨床試用的結(jié)果表明，ASA只對部分血栓栓塞性疾病有效。根據(jù)丹麥科學(xué)家的報(bào)道，預(yù)防性應(yīng)用ASA有可能導(dǎo)致上消化道出血。長期服用小劑量ASA，胃粘膜前列腺素水平明顯下降，對胃粘膜有刺激和損傷作用，同時(shí)上消化道出血的危險(xiǎn)增加，ASA和非類固醇抗炎藥合用時(shí)，上消化道出血的危險(xiǎn)更大。使用大劑量ASA可引起惡心嘔吐、耳鳴、重聽、眩暈、視力減退等所謂水楊酸反應(yīng)，還可引起局部過敏反應(yīng)（如蕁麻疹、血管神經(jīng)性水腫，嚴(yán)重者可出現(xiàn)喉頭水腫，使病人發(fā)生窒息）和全身過敏反應(yīng)（如誘發(fā)哮喘或過敏性休克）。另外，肝臟損害作用與水楊酸的血藥濃度是平行關(guān)系，而以25mg/100mL為損肝閾值，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶升高、黃疸、局限性肝壞死。ASA也可引起腎髓質(zhì)缺血，繼而發(fā)生腎乳頭壞死。他汀類藥物ATV具有可靠的調(diào)血脂作用，其是選擇性、競爭性HMG-CoA還原酶抑制劑，通過抑制HMG-CoA還原酶，減少肝細(xì)胞合成及儲存膽固醇，加快LDL-C的代謝清除，從而降低血中TC、LDL-C，同時(shí)具有降低TG的作用，同時(shí)可抑制患者血小板聚集反應(yīng)^［5］。因此對血脂升高尤其是膽固醇升高引起的動脈粥樣硬化和血粘度增高及血小板聚集引起的血管阻塞性疾病有較好的療效，但會引起口干、便秘、腹痛、消化不良、流感樣癥狀、轉(zhuǎn)氨酶升高等不良反應(yīng)，還會引發(fā)皮疹。他汀類最嚴(yán)重的不良反應(yīng)是肝毒性和肌病，包括肌炎和橫紋肌溶解^［6］，臨床表現(xiàn)為肌無力、肌痛、少尿或無尿、血清肌酸激酶(CK)增高，雖然罕見，卻有ATV引起肝酶升高和肌痛的報(bào)道。肝酶的升高（>3倍正常值）與劑量相關(guān)，劑量越大，毒副作用越大。因而，研究療效更好而不良反應(yīng)較少較輕的抗血小板藥物顯得非常重要。

本實(shí)驗(yàn)表明，無論離體還是在體試驗(yàn)，ASA、ATV聯(lián)用均有抑制AA或ADP誘導(dǎo)的家兔血小板的聚集作用，且聯(lián)用單用ASA和ATV作用更強(qiáng)。提示聯(lián)合用藥可能會增強(qiáng)對血小板聚集引起的包括心腦梗塞在內(nèi)的血栓栓塞疾病的防治效果，同時(shí)可減少單藥的劑量而降低毒副作用，使用藥更安全有效。結(jié)果還表明，隨在體試驗(yàn)的劑量較離體試驗(yàn)的劑量為小，作用也相應(yīng)減弱，說明ASA、ATV及其聯(lián)用對在體和離體家兔血小板聚集的抑制作用具有正相關(guān)性。至于聯(lián)合應(yīng)用后作用增強(qiáng)的機(jī)制以及是否具有劑量依賴性等有待進(jìn)一步探討。

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（責(zé)任編輯：陳涌濤）

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請以PDF格式閱讀原文