生物傳感分析儀測定葡萄糖和Ｌ－乳酸的影響因素研究

摘 要：生物傳感分析儀廣泛應用于食品發酵工業和實驗室研究中，為了使其更好地應用于發酵工業和實驗室檢測，本研究考察了pH、無機鹽的種類和濃度對 SBA-40C型生物傳感分析儀測定葡萄糖和L-乳酸準確性的影響，同時還考察了葡萄糖和乳酸測定的重復性及二者對測定是否存在相互干擾。結果表明：pH條件會嚴重影響測定結果，特別是影響L-乳酸測定的準確性；另外，當樣品中的 NaCl和NH4Cl濃度≥0.06mol/L時會使葡萄糖和L-乳酸測定值明顯偏低。

關鍵詞：測定；L-乳酸；葡萄糖；生物傳感分析儀

中圖分類號：TP212.3文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2008）09-0005-03

葡萄糖和乳酸是食品及微生物發酵工業的兩個重要檢測指標^［1~2］。目前還原糖分析常用的斐林(Fehling) 法、碘量法和葡萄糖氧化酶-過氧化物酶終點比色法等在一定程度上存在著操作繁瑣、費時費力、不準確及無法適應生產過程監控等弊端^［3］。發酵液中乳酸含量的定量方法有比色法^［4］、EDTA 滴定法^［5］、HPLC 分析法^［6］和酶法等。HPLC 法儀器昂貴，比色法測定耗時多、 誤差大，EDTA法雖快速，但測定的是發酵液中的總酸。此外，比色法及EDTA 法均不能用于D-型、L-型乳酸的分別定量。 因此， 基于酶法測定葡萄糖和L-乳酸的生物傳感分析儀為發酵工業測定帶來了極大的方便，其特點是方便、準確、快速、專一性強、價格低廉、便于自動控制^［7］。然而，在食品和發酵液檢測中常存在一些干擾因素，嚴重影響了測定的準確性。本研究考察了pH、L-乳酸濃度/葡萄糖濃度、離子種類和強度等工業發酵中常見因素對 SBA-40C型生物傳感分析儀測定葡萄糖和L-乳酸的影響，以便使生物傳感分析儀能更好地應用于發酵工業。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

SBA-40C型生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所研制。其測定葡萄糖和L-乳酸的原理分別是： D-葡萄糖+H2O葡萄糖氧化酶D-葡萄糖酸+H2O2，L-乳酸+O2乳酸氧化酶 -酮戊二酸+H2O2。

FA1004N型電子天平（0.0001g)：上海天譜分析儀器有限公司生產。

含0.100%葡萄糖和 0.050%L-乳酸的標準液，隨SBA-40C型生物傳感分析儀配給；反應標準緩沖液（生物傳感分析儀專用）； 隨SBA-40C型生物傳感分析儀配給。磷酸緩沖液：參照有關文獻配制^［8］；其它試劑均是分析純。

1.2 實驗程序和方法

實驗操作嚴格按照生物傳感分析儀操作手冊執行，新酶膜

的酶活性單位是4500u，工作酶膜酶活性單位最低限是100u。實驗中葡萄糖的濃度≤0.100%，乳酸的濃度≤0.050%，二者均在儀器的測量范圍內。

1.2.1 重復性實驗

用標準液每隔2min測定1次，連續測定20次。

1.2.2 線性關系試驗

由0.100%的葡萄糖溶液和0.050%的L-乳酸標準溶液稀釋得到各自不同濃度的溶液，用pH7.0的 0.1mol/L磷酸緩沖液稀釋。

1.2.3 pH對L-乳酸和葡萄糖測定的影響

通過高濃度磷酸緩沖液改變儀器測定

時的pH值。用不同pH值的1mol/L磷酸緩沖液稀釋得到0.050%葡萄糖和0.020%L-

乳酸進行測定。

1.2.4 無機鹽對葡萄糖和L-乳酸測定的影響

通過改變溶液中NaCl和NH4Cl的濃度，測定0.100%葡萄糖和0.050%的L-乳酸標準品的變化。

1.2.5 葡萄糖和L-乳酸相互干擾實驗

在L-乳酸溶液中添加葡萄糖配成含不同

濃度葡萄糖（0~0.100%）的0.040%的L-乳酸溶液，考察葡萄糖對L-乳酸測定

的影響。在葡萄糖溶液中添加L-乳酸配成含不同濃度（0～0. 050%）L-乳酸的

0.100%葡萄糖的溶液，考察L-乳酸對葡萄糖測定的影響。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖與L-乳酸測定的重復性

葡萄糖與L-乳酸測定的重復性見圖1。結果表明，十幾分鐘后葡萄糖的測定值有上升的趨勢，到30min才穩定。這一階段的最大誤差約為5%；乳酸的測定一直都很穩定。連續測定葡萄糖讀數走高可能與酶膜的擴散性能較差有關。

圖1 重復性實驗

2.2 線性關系實驗

葡萄糖的測定呈現良好的線性關系，結果見圖2。乳酸在濃度≤0.030%時呈線性，在高濃度時曲線出現彎曲，呈飽和趨勢，結果見圖3。測定時乳酸氧化酶活性單位是176，曲線彎曲反映了酶量不足，提示儀器規定的酶活性單位最低限（≥100）可能需要上調。

圖2 葡萄糖測定的線性關系

圖3 乳酸測定的線性關系

2.3 pH對L-乳酸和葡萄糖測定的影響

pH對葡萄糖測定的影響結果見圖4。當用pH=7.0~8.0的1mol/L磷酸緩沖液稀釋時，測定值偏高；而當用pH=5.5～7.0的1mol/L磷酸緩沖液稀釋樣品時測定值偏低。即樣品實際pH 在6.0~7.9 范圍波動時，含量為0.050%的葡萄糖測定值在0.045%~0.055%范圍內波動。對于乳酸的測定，pH影響則更為顯著，隨著pH降低，L-乳酸測定值顯著下降，當用pH為5.75的1mol/L磷酸緩沖液稀釋樣品時，0.020%的乳酸測定值僅為0.009%， 當用pH 為7.491mol/L磷酸緩沖液稀釋樣品時，0.020%的乳酸測定值為0.023%，結果見圖5。說明乳酸測定對pH極為敏感。因此，在使用中要注意樣品的緩沖能力。樣品的緩沖能力愈強，愈要精確調整樣品pH， 以保證測定結果的準確。

圖4 pH對葡萄糖（0.050%）測定的影響

圖5 pH對乳酸(0.020%)測定的影響

2.4 無機鹽對葡萄糖和L-乳酸測定的影響

不同濃度NaCl或NH4Cl（0～0.1mol/L）對葡萄糖測定的影響結果分別見圖6、圖7。結果表明，當NaCl≥0.06mol/L或NH4Cl≥0.05mol/L時，葡萄糖測定值顯著降低。在實驗濃度范圍內 NaCl對乳酸測定無顯著影響，見圖6；而NH4Cl對乳酸測定影響也較大，當濃度≥0.05mol/L 時，乳酸測定值呈下降趨勢，見圖7。這可能與酶活性受到影響有關。

圖6 NaCl對葡萄糖（0.100%）和乳酸（0.040%）測定的影響

圖7 NH4Cl對葡萄糖（0.100%）和乳酸（0.040%）測定的影響

2.5 葡萄糖和L-乳酸相互干擾實驗

乳酸和葡萄糖測定相互影響的結果表明，當樣品乳酸和葡萄糖的濃度均在儀器的正常測定范圍時，葡萄糖對乳酸測定及乳酸對葡萄糖測定均影響不大，誤差不超過3%(數據略)。

3 討論

（1）在葡萄糖和L-乳酸的測定中，如果樣品的緩沖能力較強，使測定pH發生較大偏離時，會嚴重影響測定結果，尤其對乳酸更是這樣。

（2）較高濃度的NaCl和NH4Cl 對葡萄糖的測定影響較大，在0.1mol/L時誤差高達10%；0.1mol/L NH4Cl對L-乳酸測定影響也可達10%。

（3）葡萄糖測定的線性很好，但連續高濃度測定時，數值會略有偏高。乳酸的線性相對較差，尤其是乳酸氧化酶活性較低時。測定時L-乳酸在0.030%以下線性較好。

（4）實驗中我們還發現當用固體葡萄糖新鮮配制的溶液，即使調過pH，測定結果也會與實際值存在很大的差異，最低甚至只有稱量值的30%，并且隨著時間延長測定值在不斷增大。當溶液放置1h后，測定結果才會同稱量值吻合。這可能是由于葡萄糖在水溶液中存在的旋光異構互變現象，而酶僅識別其中一種而造成的。因此，在用固體葡萄糖配制溶液時，應注意要放置平衡后再測定。

以上結果提示我們，要充分認識酶傳感器的優勢與局限性，盡量避免影響酶活性的因素進入到測定系統中，或通過設置相應對照的方法進行校正，才能取得準確的結果。

參考文獻：

［1］ 史建國，楊俊慧，孟慶軍，等. 發酵生產中還原糖和葡萄糖檢測指標的分析［J］.食品與發酵工業，2006，32(10):165-166.

［2］ 陳碧娥.單酶法快速測定發酵液中的L-乳酸［J］.華僑大學學報(自然科學版)， 1998， 19(3): 311-313.

［3］ 周娟， 陳滋青， 胡軍. 葡萄糖測定方法的比較研究［J］. 工業微生物， 1999， 29(4): 34-36.

［4］ 化學工業部上海醫藥工業研究所. 抗菌素工業分析［M］. 北京: 化學工業出版社， 1960.

［5］ 中華人民共和國衛生部藥典委員會. 中華人民共和國藥典(第二部)［M］. 北京: 化學工業出版社， 1985.

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［7］ 孫士清， 王寧， 何偉，等. 酶電極法測定葡萄糖注射液中葡萄糖含量的研究［J］.中國藥學， 1994，29(9): 546-547.

［8］ 吳冠蕓，潘華珍，吳錫.生物化學與分子生物學實驗常用數據手冊［M］. 北京: 科學出版社， 1999.

（責任編輯：姜付平）

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