透明質酸修飾的載大黃素多壁碳納米管遞藥系統的制備及對乳腺癌細胞的抑制作用研究

關鍵詞 大黃素；多壁碳納米管；透明質酸；遞藥系統；乳腺癌；抑制作用

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤，其發病率居高不下，位于我國婦科惡性腫瘤前列，且呈年輕化趨勢，嚴重威脅女性的身心健康和生命安全[1―2]。目前，中醫藥在乳腺癌治療領域的應用備受學者重視[3]。大黃素（emodin，EMD），又稱1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，是提取自傳統中藥大黃的天然蒽醌類衍生物，具有顯著的抗癌活性，能夠抑制乳腺癌細胞的生長、增殖、侵襲[4―5]。然而，該成分對腫瘤細胞的靶向性較弱，且生物利用度不高[6]，故有必要設計并構建能提升EMD 抗癌效果的遞藥系統。

碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）是一種新型遞藥系統，根據石墨烯層數分為單壁碳納米管、雙壁碳納米管和多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）3 種類型，其中MWCNTs 較其余類型具有更大的比表面積及更好的分散性。研究表明，CNTs 能將藥物分子遞送至腫瘤細胞，且其表面存在的不同官能團有助于靶向腫瘤細胞，從而明顯提升藥物的生物利用度并延長藥物的半衰期[7―8]。透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種高級多糖，具有低毒性、低免疫反應、可生物降解、可吸收等特性，能選擇性地結合高表達于乳腺癌等多種實體瘤細胞表面的糖蛋白分化群44（cluster ofdifferentiation 44，CD44），被廣泛用于抗癌藥物CNTs 主動靶向遞藥系統的研發領域[9]。鑒于現有EMD相關遞藥系統的研發成果[9―10]，本課題組推測HA修飾的負載EMD的MWCNTs 主動靶向遞藥系統可能有助于進一步增強EMD對乳腺癌的抗癌活性。基于此，本研究擬制備HA修飾的負載EMD的MWCNTs 遞藥系統（以下簡稱“HA-MWCNTs-EMD”），并探究其對乳腺癌細胞的體外抑制作用，以期為提升EMD相關制劑在乳腺癌治療中的遞藥效率提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Attune NxT 型流式細胞儀、Multiskan SkyHigh 型全波長自動酶標儀、EVOS型熒光倒置顯微鏡（美國Thermo Fisher Scientific 公司），Tecnai F20 型透射電子顯微鏡（美國FEI 公司），Nano-ZS90 型激光納米粒度儀（英國Malvern 公司），UV 2550型紫外分光光度計（日本Shimadzu 公司），EClassical3200L型超高效液相色譜（UPLC）儀（大連依利特分析儀器有限公司），OLS5100-LAF型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司），VCX2500 型超聲波破碎儀（美國Sonics公司），HH.CP-01T型細胞培養箱（上海川昱實驗儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

EMD 對照品（批號110756-201913，純度96.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；氨基化MWCNTs（批號XFM62，外徑8～15 nm，長度50 μm，純度＞95%）購自南京先豐納米材料科技有限公司；HA 對照品（批號LM1078，純度≥95.0%）購自上海聯邁生物工程有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒、磺酰羅丹明B（sulforhodamine B，SRB）檢測試劑盒、TUNEL檢測試劑盒、FITC 熒光標記的鼠抗CD44 抗體、FITC熒光標記的山羊抗人免疫球蛋白G抗體（批號分別為ab102526、ab235935、ab66108、ab30405、ab81051）均購自英國Abcam公司；MCF-7細胞專用培養基、Leibovitz’sL-15 基礎培養基、青-鏈霉素雙抗、胎牛血清（批號分別為CM-0149、PM151010、PB180120、164210-50）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 實驗細胞

人乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231（批號分別為CL-0149、CL-0150）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 遞藥系統的制備與表征

2.1.1 負載EMD的MWCNTs 遞藥系統的制備

取EMD對照品和氨基化MWCNTs 各10 mg，分散于10 mL無水乙醇中，超聲（功率400 W，頻率40 kHz）處理6 h；經截留分子量為100 kDa 的超濾膜，離心（9 000r/min，30 min），過濾；收集固體，于室溫下真空干燥30min 后，分散于10 mL水中，再次超聲（功率400 W，頻率40 kHz）處理6 h；用孔徑為5 mm的濾膜過濾，以除去游離的EMD；濾液經冷凍干燥，即得負載EMD 的MWCNTs 遞藥系統（以下簡稱“MWCNTs-EMD”），得率為62.35%。

2.1.2 HA-MWCNTs-EMD的制備

取HA對照品40 mg，以磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解，配制成質量濃度為2 mg/mL 的溶液。取該溶液20 mL，加入“2.1.1”項下MWCNTs-EMD 20 mg，充分懸浮1 h后，離心（9 000 r/min，30 min）；取沉淀，以水洗滌3 次；收集沉淀，于室溫下干燥，即得HA-MWCNTs-EMD，得率為67.20%。

2.1.3 遞藥系統的表征

（1）包封率和載藥量：采用紫外分光光度法于254nm波長下檢測樣品中EMD的質量濃度。以EMD吸光度（Y）對其質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.011 3X+0.012 1（r＝0.999 7），EMD 檢測質量濃度的線性范圍為0.2～80 g/mL；精密度、準確度、回收率等方法學考察均符合2020 年版《中國藥典》（四部）的相關要求。

取“2.1.1”項下制備MWCNTs-EMD 時首次離心過濾所得的上清液，以及經孔徑5 mm濾膜過濾的濾液（含游離EMD），分別用水適量稀釋，按上述紫外分光光度法檢測溶液中EMD的量，兩者之和即為制備MWCNTs-EMD 時未被包封EMD 的量；取“2.1.2”項下制備HAMWCNTs-EMD 時經水洗滌3 次后的上清液（含游離EMD），分別用水適量稀釋，按上述紫外分光光度法檢測溶液中EMD 的量，三者之和即為制備HA-MWCNTs-EMD時未被包封EMD的量；EMD總量為遞藥系統制備時所加EMD的量；遞藥系統總量為最終所得制劑的量。按如下公式分別計算包封率和載藥量：包封率＝（EMD總量－未被包封EMD 的量）/EMD 總量×100%，載藥量＝（EMD 總量－未被包封EMD 的量）/遞藥系統總量×100%。每樣品平行測定3 次。結果顯示，MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD 的包封率均為（63.52±2.74）% ，載藥量分別為（25.01±1.83）% 、（12.13±1.96）%。

（2）粒徑和Zeta 電位：按“2.1.1”“2.1.2”項下方法分別制備3 批MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD。取上述制劑各1 mg，以水2 mL分散后，使用透射電子顯微鏡觀察其微觀形態，并采用激光納米粒度儀測定其粒徑、多分散性系數（polydispersity index，PDI）和Zeta 電位。結果顯示（圖1、圖2、表1），MWCNTs-EMD、HAMWCNTs-EMD均呈管狀，MWCNTs-EMD粒徑更大且分散性更高，而HA-MWCNTs-EMD則較為聚集，粒徑較小且分散性低；MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD的粒徑均呈正態分布；MWCNTs-EMD 荷正電，而HAMWCNTs-EMD荷負電。

2.2 體外釋藥情況考察

采用UPLC 法測定透析樣品中EMD 的質量濃度。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相為甲醇-水-乙酸（60∶35∶65，V/V/V），激發波長、發射波長分別為495、545 nm，柱溫為35 ℃，流速為0.3 mL，進樣量為3 μL。以EMD峰面積（Y）對其質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.010 9X+0.011 8（r＝0.998 9），EMD檢測質量濃度的線性范圍為2.01～40.20 μg/mL；精密度、準確度、回收率等方法學考察均符合2020年版《中國藥典》（四部）的相關要求。

采用透析法評價制劑的體外釋藥情況。取EMD對照品和“2.1.1”“2.1.2”項下的MWCNTs-EMD、HAMWCNTs-EMD各適量（以EMD計，均為50 μg），以水1mL 分散，再置于透析袋中。將透析袋兩端扎緊，置于30 mL釋放介質（PBS）中，于37 ℃下以100 r/min 的轉速振搖；分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 時取出透析樣品1mL，并補充等溫等體積釋放介質。向透析樣品中加入甲醇，稀釋并定容至2 mL，再采用上述UPLC 法測定透析樣品中EMD的量，并按下式計算累積釋放量：累積釋放量＝透析樣品中EMD的量/EMD總量×100%。采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。實驗數據以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；檢驗水準α＝0.05（統計方法下同）。

結果顯示（圖3），與游離EMD 相比，MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD 在2～24 h 各時間點的累積釋放量均顯著降低（P＜0.05），而HA-MWCNTs-EMD在上述時間點的累積釋放量均顯著高于同期MWCNTs-EMD（P＜0.05）。

2.3 乳腺癌細胞對不同遞藥系統內EMD的攝取情況檢測

2.3.1 細胞培養

取MCF-7 細胞，接種于MCF-7 專用培養基中；取MDA-MB-231 細胞，接種于MDA-MB-231 專用培養基（Leibovitz’s L-15 基礎培養基+1% 青-鏈霉素雙抗+10%胎牛血清）中，于37 ℃、5%CO2、相對濕度95% 條件下培養。

2.3.2 細胞攝取情況檢測

采用細胞攝取實驗檢測。取MCF-7、MDA-MB-231細胞，按“2.3.1”項下條件培養，待傳代2 次后，接種于激光共聚焦專用24 孔板內，培養24 h 后吸棄培養液，細胞經PBS 漂洗3 次后隨機分為游離EMD 組、MWCNTs-EMD組、HA-MWCNTs-EMD組，每組設置6 個復孔。3組細胞分別以EMD、MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD溶液（藥液以不含血清的專用培養基為溶劑，終濃度以EMD計均為40 μmol/L[11]）培養；3 h 后，收集細胞，以預冷的PBS 清洗，經4% 多聚甲醛溶液固定、Hoechst33258染色后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察，采集各組細胞圖像并定量分析各組細胞的EMD攝取量（即實驗組細胞熒光強度與游離EMD組細胞熒光強度的比值）。

結果顯示（圖4、表2；限于篇幅，MDA-MB-231 細胞的相關結果可掃描本文首頁二維碼鏈接頁面中“增強出版”板塊查看附圖1），與游離EMD 組相比，MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD組兩種細胞的EMD攝取量均顯著升高（P＜0.05）；與MWCNTs-EMD 組相比，HAMWCNTs-EMD組兩種細胞的EMD攝取量亦顯著升高（P＜0.05）。

2.4 不同遞藥系統對乳腺癌細胞表面CD44 表達的影響檢測

采用流式細胞實驗檢測。取MCF-7、MDA-MB-231細胞，按“2.3.1”項下條件培養，待傳代2 次后按“2.3.2”項下方法分組（每組設置6個復孔）、處理。培養3 h后，收集各組細胞，以預冷的70% 乙醇固定并制成1×106個/mL的單細胞懸液；將上述懸液平分為兩份，一份加入10μg/mL FITC 熒光標記的CD44 抗體，另一份加入10μg/mL FITC 熒光標記的免疫球蛋白G 抗體，避光孵育20 min；收集細胞，以PBS 清洗后，使用流式細胞儀檢測，以CD44抗體的熒光強度表示其表達水平。

結果顯示（圖5、表3；限于篇幅，MDA-MB-231 細胞的相關結果可掃描本文首頁二維碼鏈接頁面中“增強出版”板塊查看附圖2），與游離EMD 組、MWCNTs-EMD組相比，HA-MWCNTs-EMD組兩種細胞表面CD44 的表達均顯著下調（P＜0.05）。

2.5 不同遞藥系統對乳腺癌細胞活力的影響檢測

采用SRB 法檢測。取MCF-7、MDA-MB-231 細胞，按“2.3.1”項下條件培養，待傳代2 次后以1×104個/孔接種于96 孔板中，培養過夜；收集細胞，分別用相應濃度的EMD、MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD（終濃度以EMD計均分別為0、10、20、40、60 μmol/L[11]）處理，并設置不含細胞、不含藥物的調零組，每濃度設置6 個復孔。培養24 h 后，收集細胞，用預冷的10% 三氯乙酸溶液固定，加入0.4%SRB溶液染色20 min，再以1% 乙酸溶液清洗，使用全波長自動酶標儀檢測各組細胞的吸光度，并按下式計算細胞活力：細胞活力（%）＝（各濃度EMD處理細胞的吸光度－調零組細胞的吸光度）/（0 μmol/LEMD 處理細胞的吸光度－調零組細胞的吸光度）×100%。

結果顯示（圖6），與0 μmol/L 游離EMD、MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD相比，其余濃度的游離EMD、MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD 均可顯著降低上述兩種細胞的活力（P＜0.05）。與同濃度游離EMD相比，經MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD處理的上述兩種細胞的活力均顯著降低（P＜0.05）；與同濃度MWCNTs-EMD 相比，經HA-MWCNTs-EMD 處理的兩種細胞的活力亦顯著降低（P＜0.05）。

2.6 不同遞藥系統對乳腺癌細胞凋亡和LDH釋放量的影響檢測

采用TUNEL 染色法檢測細胞凋亡情況。取MCF-7、MDA-MB-231 細胞，按“2.3.1”項下條件培養，待傳代2次后將細胞分為空白對照組和游離EMD組、MWCNTs-EMD組、HA-MWCNTs-EMD組，每組設置6 個復孔。4組細胞分別以不含血清的專用培養基或EMD、MWCNTs-EMD、HA-MWCNTs-EMD溶液（以不含血清的專用培養基為溶劑，終濃度以EMD計均為40 μmol/L[11]）培養；24 h后，收集細胞，經預冷的PBS 清洗、4% 多聚甲醛溶液固定、TUNEL染色、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復染后，使用熒光顯微鏡觀察各組細胞的凋亡情況（凋亡細胞呈綠色），并按下式計算細胞凋亡率：細胞凋亡率（%）＝凋亡細胞數/總細胞數×100%。

采用比色法檢測細胞的LDH 釋放量。取MCF-7、MDA-MB-231 細胞，按“2.3.1”項下條件培養，待傳代2次后按前述TUNEL 實驗分組（每組設置6 個復孔）、處理。培養24 h 后，收集細胞上清液，離心（1 000 r/min，10 min），按照LDH檢測試劑盒說明書方法檢測上清液中LDH水平，即為各組細胞的LDH釋放量。

結果顯示（圖7、表4；限于篇幅，MDA-MB-231 細胞的相關結果可掃描本文首頁二維碼鏈接頁面中“增強出版”板塊查看附圖3），與空白對照組相比，游離EMD組、MWCNTs-EMD 組、HA-MWCNTs-EMD 組凋亡細胞有所增多，其凋亡率、LDH釋放量均顯著升高（P＜0.05）；與游離EMD組相比，MWCNTs-EMD組、HA-MWCNTs-EMD組凋亡細胞亦有所增多，凋亡率、LDH釋放量亦顯著升高（P＜0.05）；與MWCNTs-EMD 組相比，HAMWCNTs-EMD組凋亡細胞亦有所增多，凋亡率、LDH釋放量亦顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

目前，臨床治療乳腺癌的常用方法是手術切除和化療，但多柔比星、順鉑、紫杉醇等化療藥物都缺乏特異性，且會對正常細胞產生明顯的毒副作用，還會因腫瘤細胞耐藥而導致治療中斷，嚴重影響患者的治療效果和生活質量[1―2，12]。傳統中藥的安全性較高，故在乳腺癌治療領域得以廣泛應用[13]。蒽醌類衍生物廣泛存在于鼠李科、茜草科、豆科、虎杖科等藥用植物中，具有明顯的抗癌活性，因而備受學界關注。EMD是源自傳統中藥大黃的一種蒽醌類衍生物，有顯著的抗乳腺癌作用[4―5]，可減輕乳腺癌小鼠體內的炎癥反應，抑制腫瘤細胞的生長和肺轉移[14]。然而，該成分的生物利用度較低，故其在抗癌領域的應用前景有限[6]。研究表明，通過結構修飾或構建納米載體系統可有效克服EMD這一缺陷，進而提升其抗癌活性[6]。CNTs 是常用于構建遞藥系統的納米材料，具有良好的細胞膜穿透性，可通過化學鍵合或者物理封裝的方式包載穿透性較差的藥物，并將其送入目的細胞內，以提升藥物的生物利用度[15]。Mumtaz等[16]通過納米技術構建了一種新型遞藥系統，可將喜樹堿、姜黃素、蘆薈大黃素等天然成分輸送到實驗動物大腦內的特定部位，進而增強其對膠質母細胞瘤的抑制作用。本研究以氨基化MWCNTs 為載體，制備了負載EMD的新型遞藥系統MWCNTs-EMD。相關體外釋藥和細胞攝取實驗結果顯示，與游離EMD相比，該遞藥系統可明顯降低藥物的24 h 累積釋放量，并可顯著提高兩種乳腺癌細胞（MCF-7、MDA-MB-231 細胞）對藥物的攝取量，表明MWCNTs-EMD具有一定的緩釋作用，并能提高靶向至乳腺癌細胞的EMD遞送量。進一步的細胞活力、凋亡、LDH 釋放量檢測結果顯示，游離EMD 和MWCNTs-EMD均可顯著降低兩種乳腺癌細胞的活力，顯著升高其凋亡率和LDH釋放量，表明兩者均可有效抑制乳腺癌細胞的增殖，誘導其凋亡并增加乳腺癌預后指標LDH的釋放。同時，本研究結果還表明，相較于游離EMD，MWCNTs-EMD對乳腺癌細胞的抑制作用更強，提示以MWCNTs 制備新型遞藥系統可提升EMD對乳腺癌的抑制作用。

CNTs 表面疏水性較強，在細胞中易聚集，但若借助表面修飾方法將一些親水性基團接枝到CNTs 表面，可有效改善遞藥系統的分散性和穩定性。HA 是常用于CNTs 遞藥系統表面修飾的親水多糖，可與腫瘤細胞表面的CD44 特異性結合，進而明顯提升其細胞靶向性和抗癌藥物遞送效率，提高藥物在腫瘤部位的濃度以及抗癌活性，故在抗癌藥物遞藥系統研發領域具有廣闊的應用前景[17―18]。本研究結果顯示，MWCNTs-EMD的Zeta電位為（23.87±0.14）mV，荷正電。HA為陰離子多糖，可通過靜電吸附作用包裹在MWCNTs-EMD表面，遂以此構建HA-MWCNTs-EMD。表征結果顯示，所制HAMWCNTs-EMD 的Zeta 電位為（－42.79±0.39）mV，荷負電；且該遞藥系統分布均勻，粒徑及PDI 均小于MWCNTs-EMD。體外釋藥實驗結果顯示，相同時間內，HA-MWCNTs-EMD中EMD的累積釋放量較游離EMD低，但較MWCNTs-EMD 高。這表明HA-MWCNTs-EMD 具有一定的緩釋作用；但HA 作為典型的親水多糖，可增加遞藥系統的水溶性，促使系統包載的EMD被釋放出來，從而提升EMD的釋放量。與此同時，EMD攝取實驗和CD44 表達檢測結果顯示，HA-MWCNTs-EMD組兩種乳腺癌細胞的EMD攝取量均顯著高于游離EMD 組、MWCNTs-EMD 組，而該組兩種細胞表面CD44 的表達均顯著低于游離EMD組、MWCNTs-EMD組，提示HA-MWCNTs-EMD 的遞送效率較MWCNTs-EMD有明顯提升。進一步的細胞活力、凋亡、LDH釋放量檢測結果顯示，與游離EMD組、MWCNTs-EMD組比較，HA-MWCNTs-EMD組兩種乳腺癌細胞的活力均顯著降低，凋亡率、LDH釋放量均顯著升高，表明該遞藥系統對乳腺癌的抑制作用強于游離EMD，且明顯強于MWCNTs-EMD。

綜上所述，本研究成功制備了負載EMD的新型遞藥系統HA-MWCNTs-EMD，該系統具有一定的緩釋作用，可明顯降低乳腺癌細胞活力，促進其凋亡并增加LDH釋放，且上述抗乳腺癌作用明顯強于游離EMD和MWCNTs-EMD。