基于代謝組學探討氯胺酮致小鼠認知障礙的機制

氯胺酮是苯環己哌啶衍生物，是N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體非競爭性拮抗劑，被廣泛應用于臨床麻醉和鎮痛[1]。近期研究指出，低劑量氯胺酮具有快速抗抑郁潛力和神經保護作用[2―3]，對創傷后應激障礙也有明顯的改善效果[4]。然而，盡管氯胺酮具有重要的醫療價值，但潛在的濫用風險極大地限制了該藥在臨床上的應用。氯胺酮具有強致幻性，長期濫用可引發多種精神障礙疾病的典型癥狀，包括焦慮、抑郁、學習記憶障礙、社交退縮、情感淡漠等，其中認知障礙是其最常見且最核心的不良反應[5―7]。目前，氯胺酮致認知障礙的神經機制仍不明確。研究表明，前額葉皮質（prefrontal cortex，PFC）中由小清蛋白陽性的γ氨基丁酸（γ aminobutyric acid，GABA）能中間神經元構成的微環路在神經可塑性調控中發揮著關鍵作用[8]；此外，PFC 是大腦的重要邊緣系統之一，對認知過程（如執行控制、注意力和工作記憶）和情緒調節至關重要[9]。代謝組學可通過識別生物體內源性代謝物的改變及特定代謝途徑進而追溯生物體內源性生理、病理狀態，已被廣泛應用于藥物濫用毒理學研究領域[10]。基于此，本研究以超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術為手段，采用代謝組學方法探討氯胺酮致認知障礙小鼠PFC內源性代謝物的變化，通過模式識別和多元統計分析，篩選差異代謝物并富集相關代謝通路，以期為揭示氯胺酮致認知障礙的關鍵代謝調控機制及其神經生物學基礎提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

Y 迷宮裝置、新物體識別（novel object recognition，NOR）系統、VisuTrack 高端動物行為分析系統均購自上海欣軟信息科技有限公司；VanquishTM Flex 型 UPLC儀、Q ExactiveTM HF-X型質譜儀、Thermo Micro 17R型臺式低溫高速離心機均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；CX22 型光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 主要藥品與試劑

氯胺酮（純度≥99%）來源于四川省公安廳；2-氯苯丙氨酸（純度≥98.5%，批號A2215290）、甲酸銨（純度≥99.9%，批號KP3VL-PL）和甲酸（質譜級）均購自美國Sigma-Aldrich 公司；甲醇、乙腈和蘇木精、伊紅染液均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；尼氏染色液（甲苯胺藍法）購自阿拉丁控股集團有限公司；無水乙醇、二甲苯、多聚甲醛均為分析純，購自成都市科隆化學品有限公司；水為自制超純水。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠24 只，5 周齡，體重20～25 g，購自川北醫學院動物中心，動物生產許可證號為SCXK（川）2023-0018。所有小鼠均飼養于室溫（25±1）℃、相對濕度40%～60%、每12 h 光暗交替的動物房中，自由攝食、飲水，適應性喂養1 周后開始實驗。所有動物實驗均遵照《實驗動物管理和使用指導》相關規定進行，并經川北醫學院倫理委員會審批通過，批準文號為CBY23-QDA03。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

參照本課題組前期實驗結果[11]，將24 只小鼠隨機分為兩組，分別為對照組（生理鹽水）和氯胺酮組（氯胺酮單次劑量25 mg/kg），每組12 只。各組小鼠按每10 g體重腹腔注射生理鹽水或相應藥液0.1 mL，每天4 次（8：30－20：30），連續10 d。

2.2 行為學測試

所有小鼠從給藥最后2 d 開始進行Y 迷宮實驗和NOR 實驗。所有測試均在50～100 lux 光照條件下進行，測試時間與小鼠的生物節律保持一致，其間保持實驗環境安靜、溫度穩定。測試前1 d，將小鼠放置在測試室中適應測試環境，以減少其對新環境的應激反應。

2.2.1 Y迷宮實驗

每組取小鼠10 只進行Y迷宮實驗，評價其空間記憶能力：Y迷宮由3 條相同的支臂（長28 cm、寬5 cm、高10cm）組成，各支臂之間的夾角為120 °。將小鼠放置于Y迷宮同一支臂的末端，讓其自由探索5 min；隨后，使用高端動物行為分析系統記錄小鼠進入支臂的總數和交替數（即連續3 次進入不同支臂的次數），并按下式計算交替率：交替率（%）＝交替數/（進入各支臂的總數－2）×100%。

2.2.2 NOR實驗

Y迷宮實驗后，每組取小鼠7 只進行NOR實驗，評價其記憶能力：NOR實驗包括T1（熟悉期）和T2（測試期）2 個實驗（每個實驗5 min，間隔1 h）。在T1 實驗中，將2 個相同的物體（A和B）放在一側壁的左右兩端，距離兩側壁約10 cm；T1 實驗結束后1 h，將A或B用新物體C取代，進行T2 實驗。使用高端動物行為分析系統記錄小鼠在T1 和T2 實驗中對物體的探索行為（前爪搭在物體上、鼻子嗅物體、舔物體等）和探索物體的時間，并根據T2 實驗結果按下式計算辨別指數（discriminationindex，DI）：DI＝探索新物體時間/（探索新物體時間+探索熟悉物體時間）×100%。

2.3 樣品的采集

行為學測試后12 h，將所有小鼠麻醉并快速灌注生理鹽水，以去除腦血管中的血液。每組隨機取小鼠3 只，灌注4% 多聚甲醛溶液后斷頭取腦，將其整腦用4% 多聚甲醛溶液固定，用于組織病理學觀察；取各組剩余小鼠，斷頭取腦，于冰上剝離其PFC 組織，經液氮速凍后，于－80 ℃下凍存，用于代謝組學檢測。

2.4 神經組織病理學形態的觀察

采用蘇木精-伊紅（HE）染色法和尼氏染色法進行觀察。取“2.3”項下各組小鼠經固定的腦組織，從前囟切取PFC區，進行常規石蠟包埋后切片，分別經HE染色和尼氏染色后，使用顯微鏡觀察其神經組織病理學形態變化并拍照記錄（每個PFC 樣品選3 個區域拍照）。采用Image Pro Plus 軟件采集尼氏染色陽性（呈藍色的細粒狀或斑塊狀）區域的光密度（optical density，OD）值，再計算該OD值與對應區域面積的比值，即平均光密度（meanoptical density，MOD），用以表示尼氏小體的總量。

2.5 PFC代謝組學分析

2.5.1 PFC組織樣品前處理

取“2.3”項下各組小鼠凍存的PFC組織，精密稱取適量，置于2 mL EP 管中，精密加入預冷的組織提取液[75% 甲醇-氯仿（9∶1，V/V）+25% 水]1 mL，加入3 顆鋼珠，使用研磨儀（頻率50 Hz）冷凍研磨60 s×2 次；于室溫下超聲30 min 后，于冰上靜置30 min；于4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min，取上清液850 μL至2 mL離心管中，真空下濃縮至盡干；干燥物用含50%乙腈的4 mg/L的2-氯苯丙氨酸溶液100 μL 復溶，經0.22 μm 濾膜過濾，取濾液，備測。

2.5.2 UPLC-MS/MS分析及數據采集

取“2.5.1”項下各組小鼠PFC 組織樣品溶液，進行UPLC-MS/MS 分析。色譜柱為ACQUITY UPLC? HSST3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相為0.1% 甲酸溶液（A）-0.1% 甲酸乙腈溶液（B）（正離子模式）或5 mmol/L甲酸銨溶液（C）-乙腈（D）（負離子模式），進行梯度洗脫（0～1 min，98%A 或98%C；1～9 min，98%A→50%A 或98%C→50%C；9～12 min，50%A→2%A或50%C→2%C；12～13.5 min，2%A或2%C；13.5～14 min，2%A→98%A或2%C→98%C；14～17 min，98%A或98%C）；自動進樣器溫度為8 ℃；流速為0.25 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為2 μL。采用電噴霧離子源進行正、負離子掃描；噴霧電壓為3.50 kV（正離子模式）、2.50 kV（負離子模式）；鞘氣壓力為30 arb，輔助氣壓力為10 arb；毛細管溫度為325 ℃；全掃描分辨率為60 000，掃描范圍為m/z 81～1 000；碰撞電壓為30 eV；同時，采用動態排除法去除無必要的MS/MS信號。

2.5.3 數據的預處理及分析

收集樣品質譜信息后，采用ProteoWizard 3.0.8789軟件將其格式轉換為“mzXML”，然后使用R 3.3.2 軟件的“XCMS”程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊及歸一化處理，獲得包括m/z、保留時間、峰面積在內的數據矩陣；隨后，借助數據質量檢查刪除信號強度變異系數大于30% 的信號峰，余下數據經填補缺失值、數據標準化等預處理后進行統計分析，包括Student’s t 檢驗和代謝物水平變化倍數（fold change，FC）分析等單變量統計分析，以及主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法- 判別分析（partial least squaresdiscriminantanalysis，PLS-DA）等多元統計分析。以t 檢驗校正P 值＜0.05 及PLS-DA 分析的變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值＞1 為標準篩選差異代謝物[12]。代謝物的鑒定參照其精確分子量（分子量誤差＜30×10－6）及MS/MS 模式所得碎片信息在HMDB、Metlin、LipidMaps 等數據庫中匹配注釋的準確信息。

2.5.4 差異代謝物及代謝通路分析

將篩選出的差異代謝物導入MetaboAnalyst 5.0 在線平臺的“pathway analysis”模塊進行通路分析。該分析模塊基于京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG），采用超幾何檢驗數據分析算法和相對中介中心性拓撲結構進行代謝通路分析。通路分析結果中，P 值＜0.05 的通路被認定為存在顯著改變的代謝通路。

2.6 數據統計與分析

采用GraphPad Prism 9 軟件進行數據統計分析和圖表繪制。實驗數據均以x±s 表示，采用t 檢驗進行比較。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 行為學測試結果

Y迷宮實驗結果顯示，與對照組比較，氯胺酮組小鼠的交替率顯著降低（P＜0.05）。NOR實驗結果顯示，T1 實驗中，兩組小鼠對2 個物體的探索時間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；T2 實驗中，對照組小鼠對新物體C的探索時間顯著長于其對熟悉物體A的探索時間（P＜0.05），而氯胺酮組小鼠對新物體C和熟悉物體A的探索時間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；此外，與對照組比較，氯胺酮組小鼠的DI 顯著降低（P＜0.01）。這提示氯胺酮可導致小鼠認知行為缺陷。結果見表1。

3.2 神經組織病理學形態觀察結果

HE 染色結果顯示，對照組小鼠PFC 組織神經元分布正常，形態結構完整，細胞核呈圓形且清晰可見；氯胺酮組小鼠PFC 組織神經元形態不一，呈多種不規則形狀，細胞核周圍出現空腔、核固縮，核深染細胞增多。尼氏染色結果顯示，氯胺酮組小鼠PFC 組織內尼氏染色陽性區域的MOD為0.002 6±0.001 3，顯著低于對照組小鼠的0.005 8±0.001 9（P＜0.05）。這提示氯胺酮可引起小鼠PFC組織神經元損傷。結果見圖1。

3.3 代謝組學分析結果

3.3.1 PFC組織樣品的UPLC-MS/MS檢測結果兩組小鼠PFC組織樣品的基峰色譜圖見圖2。

PCA結果顯示，對照組和氯胺酮組小鼠PFC組織樣品分離明顯，提示氯胺酮可導致PFC組織內的代謝物發生變化。PLS-DA 結果顯示，對照組和氯胺酮組小鼠PFC 組織樣品亦分離明顯，與PCA 結果一致。PLS-DA模型的置換檢驗（正離子模式，200 次）結果顯示，R 2＝0.999、Q 2＝0.959，提示模型可靠、擬合準確[13]。

3.3.2 差異代謝物分析結果

在正、負離子模式下，本研究共篩選出114 種差異代謝物，其中表達上調的有73 種、下調的有41 種。部分結果見表2。

3.3.3 差異代謝物通路富集結果

對上述篩選出的114 種差異代謝物進行KEGG通路富集分析，結果（圖3）顯示，PFC組織內的差異代謝物主要涉及的代謝相關通路包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，GABA能突觸，嘧啶代謝，膽堿能突觸等。

4 討論

4.1 氯胺酮對小鼠認知行為能力的影響

氯胺酮是NMDA受體非競爭性拮抗劑，反復或長期使用所致精神障礙的主要癥狀包括焦慮、抑郁、情景記憶/工作記憶缺陷、情感冷漠、社交退縮及刻板行為等，其中核心行為缺陷涉及注意力、執行功能、工作（短期）記憶、長期記憶缺陷等認知障礙。本研究采用Y迷宮實驗和NOR 實驗考察了氯胺酮對小鼠學習記憶能力的影響，結果顯示，氯胺酮組小鼠的交替率、DI均顯著低于對照組，與一項氯胺酮單日累積劑量100 mg/kg、重復給藥8 d 的研究結果基本一致[14]，即氯胺酮可導致小鼠認知缺陷。

PFC是大腦的邊緣系統之一，是調節行為、情緒、學習記憶等高級神經活動的重要部位，其調節作用的發揮與神經元形態、數量等密切相關。HE染色和尼氏染色實驗結果表明，氯胺酮可導致PFC 組織神經元受損，尼氏染色陽性區域MOD明顯降低，與已有文獻報道[15]基本一致，即氯胺酮長期使用可導致小鼠腦組織神經元受損，進而誘導認知障礙。

4.2 代謝組學技術探討氯胺酮致認知缺陷的可能機制

代謝組學是系統生物學的主要組成部分，有助于挖掘表型變化的“線索”。PFC 組織代謝組學研究結果顯示，從氯胺酮組和對照組小鼠PFC組織樣品中共鑒定出114 種差異代謝物，其中表達上調的有73 種，表達下調的有41 種；主要參與的代謝相關通路包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，GABA能突觸，嘧啶代謝，膽堿能突觸等，其中影響較大的為GABA能突觸和氨基酸代謝通路。

GABA能突觸可通過GABA受體介導的抑制性傳導來維持中樞神經系統興奮及抑制間的動態平衡，這對正常腦功能的維持至關重要。研究指出，GABA能突觸抑制性傳導的異常與神經退行性疾病、精神分裂癥及認知障礙等神經精神疾病的發生發展密切相關[16]。本研究結果顯示，在氯胺酮致小鼠認知障礙的差異代謝物中，有多種代謝物與GABA能突觸有關，包括谷氨酰胺、琥珀酸、酮戊二酸等。研究指出，谷氨酰胺、琥珀酸及酮戊二酸是三羧酸循環的關鍵中間體，參與細胞的能量代謝[17]，提示氯胺酮致認知障礙可能與機體能量代謝紊亂有關；此外，谷氨酰胺是谷氨酸和GABA的前體，由僅存在于星形膠質細胞中的谷氨酰胺合成酶催化合成，上述催化過程異常與反應性星形細胞增多相關[11]。由此可見，谷氨酰胺代謝紊亂可導致谷氨酸能和GABA能突觸傳遞改變，這可能是氯胺酮致認知障礙的原因之一。

本研究挖掘出多條顯著變化的氨基酸代謝通路，如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝等。研究顯示，氨基酸作為神經遞質或神經遞質前體，可影響神經突觸傳導，進而影響大腦功能；同時，氨基酸還能影響能量代謝和蛋白合成等，與大腦功能密切相關[18]。因此，氨基酸代謝異常可能也是氯胺酮致認知障礙的主要原因。

本研究結果還顯示，嘧啶代謝通路變化明顯。嘧啶是核酸合成的重要組成部分，其代謝異常與神經功能障礙和精神疾病的發生有關[19]。一項預防性氯胺酮治療作用的代謝組學研究結果顯示，氯胺酮對小鼠海馬、PFC及血漿中的嘧啶代謝有明顯影響[20]，本文結果與之基本一致。同時，膽堿能突觸變化亦明顯，相關差異代謝物包括膽堿和乙酰膽堿。一項臨床前研究表明，氯胺酮進入機體后與α7 煙堿型乙酰膽堿受體的相互作用以及對乙酰膽堿酯酶的誘導作用可能是氯胺酮致精神分裂癥樣行為尤其是認知障礙癥狀的主要原因，其主要表現為與記憶功能相關的神經遞質乙酰膽堿在大腦中的含量顯著降低[21]。Ben-Azu 等[22]研究表明，多西環素可通過增強膽堿能神經傳遞逆轉氯胺酮誘導的認知障礙。由此可見，氯胺酮致認知障礙可能亦與膽堿能突觸改變有關。

綜上所述，氯胺酮能誘導小鼠認知障礙，相關差異代謝物包括谷氨酰胺、琥珀酸、酮戊二酸、膽堿、乙酰膽堿及尿嘧啶核苷酸等，主要富集在氨基酸代謝通路、嘧啶代謝通路、GABA能突觸、膽堿能突觸等代謝相關通路，即氯胺酮神經毒性與突觸傳導、能量代謝異常及神經免疫調節紊亂有關。