人參總次苷對心肌細胞肥大性改變的改善作用及機制

心力衰竭（heart failure，HF）是指任何原因引起心肌損傷，造成心肌結構和功能發生改變，致使心室泵血功能降低而不能滿足機體代謝需要的臨床綜合征。該病致死率高，可導致患者出現呼吸困難、咳嗽、水腫等多種臨床表現，并頻繁住院[1]。盡管目前我國HF的治療取得了諸多進展，但其患病率仍呈持續升高的趨勢，該病已成為影響我國城鄉居民健康的重要因素之一[2]。研究指出，病理性心臟肥大是導致HF、心功能障礙、猝死的關鍵危險因素，而改善病理性心臟肥大可能是減緩HF 發展的有效途徑[3]。當病理性心臟肥大發生時，心肌細胞的能量代謝明顯改變，糖酵解活動異常增強，參與糖酵解途徑的缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase 3，PFKFB3）等蛋白/酶的表達明顯上調，而抑制糖酵解可有效緩解心肌細胞的肥大性改變[4―5]。

人參是我國傳統的補氣要藥，具有大補元氣、補脾益肺等功效，在HF 治療領域具有重要作用[6]。研究發現，人參皂苷Rg3可抑制血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）誘導的小鼠病理性心臟肥大，減小左心室質量，提高左室射血分數和縮短分數，且上述作用可能是通過調節能量代謝而實現的[7]；人參皂苷Rh2可通過抑制糖酵解途徑來促進腫瘤細胞的凋亡[8]。上述研究表明，人參改善心臟肥大、調節細胞糖酵解的作用與其主要活性成分人參皂苷關系密切。人參總次苷（total secondaryginsenosides，TSG）是借助相關專利技術將人參皂苷水解而得到的總皂苷，包括具有重要藥效作用的人參皂苷、稀有人參皂苷等成分，其中人參皂苷（含稀有人參皂苷）的含量不低于64%[9]。本課題組前期研究結果顯示，TSG可提高缺氧條件下人H9c2 細胞中三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）的含量，改善其能量代謝，抑制其凋亡[10]。結合上述文獻和前期研究，本課題組推測TSG 可能與心肌細胞的肥大性改變和能量代謝密切相關。基于此，本研究以新生SD 大鼠原代心肌細胞為對象，使用AngⅡ誘導構建肥大性改變心肌細胞模型，以糖酵解調節因子PFKFB3 的抑制劑PFK-015 為參照，初步探討TSG對心肌細胞肥大性改變的影響及潛在機制，以期為TSG用于臨床治療HF提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括HBS-1096A型酶標儀（南京德鐵生物科技有限公司），CIB-191TX型CO2細胞培養箱（蘇州捷美電子有限公司），FACSCelesta 型流式細胞儀[碧迪醫療器械（上海）有限公司]，ECLIPSE C1 型正置熒光顯微鏡（日本Nikon 公司），164-5050 型電泳儀電源、Mini-PROTEAN 型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot 型電泳轉印儀（美國Bio-Rad 公司），QuickChemi 5200 型化學發光成像系統（武漢莫納生物科技有限公司），TL-988 型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（西安天隆科技有限公司）等。

1.2 主要藥品和試劑

TSG原料藥（批號20190401，純度≥64%）由上海輝昱生物醫藥科技有限公司提供；AngⅡ（純度≥98%）、Ⅱ型膠原酶（批號分別為A9290、C8150）均購自北京索萊寶科技有限公司；PFK-015 對照品（純度≥99%）、CCK-8試劑（批號分別為GC16993、GK10001）均購自美國Glp‐Bio 公司；胎牛血清（批號FSP500）購自蘇州依科賽生物科技股份有限公司；DMEM 培養基（批號C11995500-BT）購自美國Gibco 公司；游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）比色法測試盒（批號E-BC-K792-M）購自武漢伊萊瑞特生物股份有限公司；0.1%Triton X-100 免疫染色通透液（批號BL934A）購自北京蘭杰柯科技有限公司；兔抗心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）多克隆抗體和藻紅蛋白標記的山羊抗兔、驢抗鼠免疫球蛋白G二抗（批號分別為15513-1-AP、SA00008-2、SA00008-9）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；鼠抗α-肌動蛋白（α-actin）單克隆抗體、兔抗HIF-1α多克隆抗體、兔抗葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter protein 4，GLUT-4）多克隆抗體、兔抗LDHA多克隆抗體、鼠抗丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、山羊抗鼠免疫球蛋白G 二抗（批號分別為YM3612、YT2133、YT5523、YN3033、YM0513、RS0001、RS0002）均購自美國Immuno-Way 公司；輔酶A（coenzyme A，CoA）檢測試劑盒（批號MAK034）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；乙酰輔酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）含量測定試劑盒（批號ACA-2B-Y）購自蘇州科銘生物技術有限公司；鼠抗α - 微管蛋白（α -tubulin）單克隆抗體（批號GTX628802）購自美國GeneTex 公司；兔抗PFKFB3 單克隆抗體（批號ab181861）購自艾博抗（上海）貿易有限公司；TRIzol 試劑（批號15596026）購自美國ThermoFisher Scientific 公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR檢測試劑盒（批號分別為FSQ-101、QPK-201）均購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；PURO-Flour 蛋白合成分析試劑盒（批號601100）購自美國Cayman Chemical 公司；所用PCR 引物由本課題組利用PrimerDesignerTM工具設計，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 實驗動物

本研究涉及的實驗動物為SPF 級新生SD 大鼠（出生1～3 d），雌雄不限，體重5～6 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2021-0011。本研究方案經河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（批準編號DWLL202203023）。

2 方法

2.1 原代心肌細胞分離、培養和鑒定

取新生SD 大鼠數只，分離其心室部分并修剪成大小約1 mm3的組織塊，加入0.25% 胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型膠原酶，經不銹鋼網（200 目）過濾后，以1 200 r/min 離心5 min，用含10% 胎牛血清的DMEM培養基重懸并接種于培養瓶中，采用差速貼壁法去除成纖維細胞（每天觀察細胞狀態，待細胞生長至80% 時進行傳代，每2 d 更換1 次培養液）。取培養72 h 的單層細胞，轉移至玻片上，用4% 甲醛溶液固定20 min后，用含0.1%Triton X-100 免疫染色通透液的磷酸鹽緩沖液（PBS）滲透10 min，再用含牛血清白蛋白的PBS封閉非特異性結合位點30 min；加入cTnT 一抗（稀釋度1∶100），于4 ℃下孵育過夜；以PBS 洗滌后，用藻紅蛋白標記的相應二抗（稀釋度1∶200）孵育1 h；使用含抗熒光淬滅劑的封片液封片后，再使用熒光顯微鏡觀察、鑒定（心肌細胞具有特異性的cTnT熒光信號）。

2.2 分組、造模與給藥

取“2.1”項下處于對數生長期的原代心肌細胞，將其分為對照組（C 組）、AngⅡ組（M組）、TSG 組（T 組）、PFK-015 組（P 組）、TSG+PFK-015 組（T+P 組）。C 組細胞不作任何處理，其余各組細胞均加入終濃度為2 μmol/L的AngⅡ（誘導濃度根據預實驗結果設置），各藥物組細胞再分別加入終濃度為7.5 μg/mL的TSG或/和10 nmol/L的PFK-015（干預濃度根據預實驗結果設置），于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。

2.3 細胞表面積檢測

按“2.2”項下方法分組（每組各4 個復孔）、造模、給藥。收集各組細胞，用4% 多聚甲醛溶液固定后再以PBS 浸洗，使用0.1%Triton X-100 免疫染色通透液于室溫下通透15 min；滴加5% 正常血清，室溫下封閉1 h；加入α-actin 一抗（稀釋度1∶200），4 ℃下孵育過夜；以PBS浸洗3 次，加入藻紅蛋白標記的相應二抗（稀釋度1∶200），37 ℃下孵育1 h；加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色試劑適量，避光孵育5 min；使用含抗熒光淬滅劑的封片液封片后，再使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件計算細胞表面積：細胞表面積（μm2/個）＝總陽性面積（呈紅色熒光）/細胞總數。

2.4 細胞蛋白合成檢測

按“2.2”項下方法分組（每組各8 個復孔）、造模、給藥。收集各組細胞，嚴格按照蛋白合成分析試劑盒說明書操作，使用酶標儀測定其相對熒光值，用以反映各組細胞的蛋白合成情況（細胞相對熒光值越大，表明其蛋白合成越異常增加，心肌細胞肥大性改變越明顯）。

2.5 細胞能量代謝相關指標含量檢測

按“2.2”項下方法分組（每組各3 個復孔）、造模、給藥。收集各組細胞，嚴格按照相應試劑盒說明書操作，使用酶標儀于特定波長下測定各孔細胞的光密度（OD）值，并按照說明書中的公式分別計算FFA、CoA、acetyl-CoA的含量。

2.6 細胞糖酵解相關因子表達檢測

采用Western blot 法檢測各組細胞中相關蛋白的表達。按“2.2”項下方法分組（每組各3 個復孔）、造模、給藥。收集各組細胞，加入含苯甲基磺酰氟的高效RIPA裂解液適量，充分裂解，并于4 ℃下以12 000 r/min 離心5 min，收集上清液，以BCA法測定蛋白濃度后進行變性處理。取變性蛋白適量，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移至聚偏二氟乙烯膜上，以封閉液于室溫下振搖封閉2 h；洗膜后，加入HIF-1α、GLUT-4、LDHA、PDK1、PFKFB3、α-tubulin 一抗（稀釋度分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋度均為1∶10 000），于室溫下振搖孵育1 h；洗膜后，以ECL發光液顯色、曝光、成像。使用Image J 軟件分析各蛋白的灰度值，以各目的蛋白與內參蛋白（α-tubulin）的灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

采用實時聚合酶鏈式反應（real-time PCR，RT-PCR）法檢測各組細胞中相關因子mRNA的表達情況。收集上述各組細胞，加入TRIzol 試劑以提取細胞總RNA。待測定其濃度、純度后，按相應試劑盒說明書方法將其反轉錄為cDNA，并以此為模板進行PCR擴增。反應體系（20 μL）包括2×SYBR Green qPCR Master Mix（無ROX染料）10 μL、正向/反向引物（具體序列及產物長度見表1）各2 μL、cDNA 模板1 μL、無核酶水5 μL。反應條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40 個循環。以α-tubulin 為內參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，結果以C組為參照進行歸一化處理。

2.7 統計學方法

采用SPSS 25.0 軟件對數據進行統計分析。實驗數據以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗（方差齊時）或Dunnett’s T3檢驗（方差不齊時）。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 原代心肌細胞的鑒定

原代心肌細胞具有特異性的cTnT 熒光信號，并多呈菱形、多邊形等不規則形狀。結果見圖1。

3.2 TSG對AngⅡ誘導原代心肌細胞表面積的影響

與C 組[（558.21±59.38）μm2/個]相比，M組細胞的表面積[（758.67±69.51）μm2/個] 顯著增大（P＜0.05）。與M組相比，T 組、P 組心肌細胞的表面積[（609.19±15.91）、（625.49±25.86）μm2/個]均顯著縮?。≒＜0.05）。與T 組、P 組相比，T+P 組心肌細胞的表面積[（561.25±55.09）μm2/個]雖有下降趨勢，但組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖2。

3.3 TSG對AngⅡ誘導原代心肌細胞蛋白合成的影響

與C組（14 013.3±424.3）相比，M組細胞的相對熒光值（28 240.4±2 143.9）顯著升高（P＜0.05）。與M組相比，T 組、P 組細胞的相對熒光值（16 163.2±1 249.8、22 843.5±1 739.7）均顯著降低（P＜0.05）。與P組相比，T+P 組細胞的相對熒光值（16 354.2±1 270.8）顯著下降（P＜0.05），但與T組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。

3.4 TSG對AngⅡ誘導原代心肌細胞中能量代謝指標含量的影響

與C組相比，M組細胞中FFA含量顯著升高，CoA、acetyl-CoA含量均顯著降低（P＜0.05）。與M組相比，T組、P 組細胞中FFA 含量均顯著降低，CoA、acetyl-CoA含量均顯著升高（P＜0.05）。與T組、P組相比，T+P組細胞中FFA含量均顯著降低，CoA、acetyl-CoA含量均顯著升高（P＜0.05）。結果見表2。

3.5 TSG對AngⅡ誘導原代心肌細胞中糖酵解相關因子表達的影響

與C 組相比，M 組細胞中HIF-1α、LDHA、PDK1、PFKFB3 蛋白及mRNA 的表達均顯著上調，GLUT-4 蛋白及mRNA 的表達均顯著下調（P＜0.05）。與M組相比，T 組、P 組細胞中HIF-1α、LDHA、PDK1、PFKFB3 蛋白及mRNA的表達均顯著下調，GLUT-4 蛋白及mRNA的表達均顯著上調（P＜0.05）。與T組、P組相比，T+P組細胞中HIF-1α、PDK1、PFKFB3 蛋白及mRNA和LDHA蛋白的表達均顯著下調，GLUT-4 蛋白及mRNA的表達均顯著上調（P＜0.05）。結果見圖3、表3。

4 討論

HF是一種以心臟泵血（充血）能力下降為特征的復雜的慢性心臟病，在其發展過程中常常伴隨著病理性心臟肥大，具體表現為心肌細胞體積增大和心臟質量增加[11]。研究指出，病理性心臟肥大與機體神經內分泌激素（如AngⅡ、內皮素-1 等）的異常分泌關系密切，這些激素可激活膜結合受體，刺激多條下游信號通路，最終引起心臟肥大[12]。因此，本研究采用AngⅡ刺激原代心肌細胞構建心肌細胞肥大模型。研究發現，細胞表面積增大和蛋白合成增加是心肌細胞肥大性改變的重要病理變化[13]。本研究結果顯示，原代心肌細胞表面積在AngⅡ的刺激下顯著增大，蛋白合成顯著增加；經TSG干預后，原代心肌細胞表面積和蛋白合成狀況均有明顯改善，提示TSG可改善AngⅡ所導致的原代心肌細胞肥大性改變。

能量代謝改變是心肌細胞發生肥大性改變的重要環節，與HF 的進展密切相關。FFA參與細胞氧化代謝并在線粒體中分解，以ATP 的形式釋放大量能量，是人體組織的重要能量來源[14]。但FFA異常升高是心血管疾病的獨立危險因素之一，可促進心肌細胞的肥大性改變，在HF 的發生過程中發揮著重要作用[15]。CoA 與人體多種合成/分解代謝有關，同時也是機體能量生成所必需的調節因子[16]。acetyl-CoA是CoA通過硫酯鍵與乙?；B接而成，可為三羧酸循環和電子傳遞鏈提供動力，是人體能量代謝的中間體和關鍵信號分子[17]。在部分細胞的能量代謝重編程中，糖酵解活動的增強不僅減少了丙酮酸向acetyl-CoA的轉化，使acetyl-CoA含量降低，同時也和異常升高的FFA密切相關[18]。本研究結果顯示，與C組相比，M組原代心肌細胞中FFA含量顯著升高，CoA、acetyl-CoA 含量均顯著降低，提示肥大性改變過程中心肌細胞的能量代謝發生了明顯的改變；給予TSG 干預后，T 組細胞的FFA 含量顯著降低，CoA、acetyl-CoA含量均顯著升高，提示TSG參與了肥大心肌細胞能量代謝的調節過程。

病理性心臟肥大發生時，能量代謝的主要特征是從脂肪酸氧化轉變為更多地依賴糖酵解[19]。HIF-1α不僅可參與調控下游葡萄糖轉運與糖酵解相關因子的表達，而且是促進心肌細胞肥大性改變的重要調節因子[20]。GLUT-4 是心肌細胞攝取葡萄糖的重要載體，能優化受損心肌組織的能量底物轉化；LDHA是細胞糖酵解的關鍵酶之一，能將糖酵解過程中產生的丙酮酸轉化為乳酸，其表達水平和糖酵解通量呈正相關[21]。PDK1 一方面可通過磷酸化丙酮酸脫氫酶復合物E1a 亞基、抑制該復合物活性來促進糖酵解，另一方面還可增強HIF-1α蛋白的穩定性，與HIF-1α形成正反饋回路[22]。PFKFB 具有多種同工酶亞型，其中PFKFB3 的活性較高，可通過調節果糖-2，6-二磷酸的生成而增加糖酵解通量，是糖酵解過程的關鍵調節因子[23]。研究表明，HIF-1α/PFKFB3信號通路可通過影響細胞的能量代謝、線粒體活性、其他信號通路表達等多種方式來促進（抑制）多種疾病的發生與進展[24]。上述研究表明，HIF-1α、GLUT-4、LDHA、PDK1、PFKFB3 的表達與糖酵解活動密切相關。本研究結果顯示，與C 組相比，M 組細胞中HIF-1α、LDHA、PDK1、PFKFB3 蛋白及mRNA的表達均顯著上調，GLUT-4 蛋白及mRNA 的表達均顯著下調，提示AngⅡ刺激下的原代心肌細胞的糖酵解活動明顯增強；給予TSG 干預后，T 組細胞中HIF-1α、LDHA、PDK1、PFKFB3 蛋白及mRNA 的表達均顯著下調，GLUT-4 蛋白及mRNA的表達均顯著上調，提示TSG可減弱AngⅡ刺激下原代心肌細胞的糖酵解活動。

PFK-015 是PFKFB3 的特異性抑制劑，能通過抑制PFKFB3 的表達來調節細胞中的葡萄糖代謝[25]?；诖?，本研究選擇PFK-015 單用、TSG+PFK-015 聯用，以進一步觀察TSG 改善AngⅡ誘導原代心肌細胞肥大性改變的潛在機制。結果顯示，P組細胞的表面積、蛋白合成均較M組顯著改善，且變化趨勢與T 組相同；T+P 組細胞的蛋白合成較P 組進一步減弱，表面積差異雖無統計學意義，但較T組、P組呈下降趨勢。進一步對能量代謝及糖酵解相關指標進行檢測，結果顯示，P組細胞能量代謝相關指標（FFA、CoA、acetyl-CoA含量）均較M組顯著"改善，糖酵解相關因子（HIF-1α、GLUT-4、LDHA、PDK1、PFKFB3 蛋白及mRNA）均較M組顯著逆轉，且變化趨勢與T 組相同；T+P 組細胞上述指標（LDHA mRNA 除外）的改變均較T組、P 組明顯。這提示TSG和PFK-015聯用可能進一步抑制了肥大心肌細胞中的糖酵解活動，表明TSG 對AngⅡ誘導原代心肌細胞肥大性改變的改善作用可能是通過抑制糖酵解活動而實現的。

綜上所述，TSG可縮小AngⅡ誘導原代心肌細胞的表面積，減少蛋白合成，抑制其肥大性改變；上述作用可能與改善細胞能量代謝、抑制糖酵解活動有關。但本研究僅選擇了一種糖酵解抑制劑，機制研究較為單一，有待后續研究進一步完善。