具有抗氧化功能的刺梨風味發酵乳制備工藝研究

摘 要： 為研制一款具有抗氧化功能的刺梨風味發酵乳，通過篩選具有抗氧化功能的益生菌、優化刺梨汁的添加量以及確定最佳的發酵菌株，初步探究了刺梨風味發酵乳的制備工藝。結果表明：經過嚴格篩選，得到了三株表現優異的益生菌——植物乳桿菌576、發酵粘液乳桿菌572和發酵粘液乳桿菌grx938，它們不僅具有良好的人工胃腸液耐受性和Caco-2細胞黏附性，還展現出較強的抗氧化能力。在確定刺梨汁的最佳添加量為15％后，選擇發酵粘液乳桿菌grx938作為發酵菌株，所制得的刺梨風味發酵乳風味濃郁、酸甜適口、口感細膩，具有高達93.92％的DPPH自由基清除率，其維生素C含量達473.3 mg／100 mL，總抗氧化能力為127.87 mmol Trolox/L。該研究結果為刺梨風味發酵乳的商業開發奠定了堅實的理論和技術基礎。

關鍵詞： 發酵粘液乳桿菌;刺梨;發酵乳;抗氧化

中圖分類號： TS 972.123.7"" 文獻標志碼： A"" 文章編號：

2095-8730（2025）01-0079-07

益生菌發酵乳因其豐富的營養價值和顯著的健康益處而備受關注。發酵過程中，益生菌產生的乳酸、短鏈脂肪酸、胞外多糖及抗菌肽等多種活性產物，不僅賦予發酵乳獨特的風味，還具備調節腸道菌群、增強免疫力以及改善代謝等有益功能^［1］。其中，益生菌發酵乳的抗氧化功能已逐漸成為研究的重點。益生菌在代謝過程中產生的抗氧化酶、多酚等物質，可以有效清除自由基，減輕氧化應激對人體的危害^［2］。然而，傳統益生菌發酵乳在風味多樣性和抗氧化活性方面仍存在一定局限性^［3-4］。近年來，將果蔬汁與發酵乳相結合，已成為功能性發酵乳新產品開發的研究熱點^［5］。果蔬汁的加入不僅豐富了產品的風味，還能通過其天然抗氧化成分與益生菌代謝產物協同作用，顯著提升抗氧化功能，為開發兼具優良口感和高抗氧化活性的功能性乳制品提供了新思路。

刺梨（Rosa roxburghii），薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實，其鮮果的維生素C含量高達2 000 mg／100 g以上，被譽為“維C之王”^［6］。同時，刺梨富含超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）及黃酮等多種抗氧化活性成分，具有較好的調節機體免疫力和延緩衰老的效用^［7］。此外，刺梨還具有濃郁的果香、花香和甜香^［8］。因此，本研究利用刺梨與具有潛在抗氧化功能的益生菌制備發酵乳，并優化制備工藝，旨在研發高附加值的刺梨益生菌發酵乳產品。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株及細胞

本實驗所用乳酸菌菌株均來自江蘇省益生菌與乳品深加工重點實驗室，其中發酵粘液乳桿菌grx938保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），編號為CGMCC No.30569。菌株名稱及縮寫如表1所示。Caco-2細胞購于南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 材料與試劑

氯化鈉、鹽酸、三氯化鐵、碳酸鈉、無水乙醇和氫氧化鈉：國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純;磷酸緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、胃蛋白酶、牛膽鹽、抗壞血酸：北京索萊寶科技有限公司;刺梨汁：貴州天刺力食品科技有限責任公司;蔗糖：麥德龍商業集團有限公司揚州邗江商場;全脂乳粉和脫脂乳粉：恒天然集團;總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒（FRAP法）及DPPH自由基清除能力試劑盒：南京建成生物工程研究所。MEM完全培養基（15％胎牛血清、100 kU／L青霉素和0.1g／L鏈霉素）：南京森貝伽生物科技有限公司;MRS肉湯：海博生物技術有限公司。

1.3 主要儀器與設備

PL2002電子天平、Fisher 13-636-XL25 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司;JF-SX-500高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司;PX-150BS-Ⅱ生化培養箱：上海新苗醫療器械;TG18-WS高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 乳酸菌活化

菌株在MRS液體培養基中于42 ℃進行兩次傳代培養后備用。在接種至脫脂乳培養基或復原全脂乳前，將活化后的菌株轉接至MRS液體培養基，于42 ℃培養至對數生長后期。

1.4.2 乳酸菌對人工胃腸液耐受性

取1 mL菌懸液分別接種至9 mL的 pH 2.0、pH 3.0的人工胃液（含0.5％ NaCl和0.3％胃蛋白酶），以及含有0.1％及0.3％膽鹽的人工腸液溶液（pH值為8的PBS）中。接種后立即取樣進行平板計數，記為0 h活菌數（C0h）。隨后，將樣品在37 ℃下培養3 h，再次取樣進行平板計數，記為3 h活菌數（C3h），根據式（1）計算存活率（％）。

存活率=C3hC0h×100%（1）

1.4.3 乳酸菌對Caco-2細胞的黏附能力

將培養的Caco-2細胞消化離心后，用MEM完全培養基將細胞濃度調整為2×105 cells／mL，接種于24孔板中培養至80％匯合度。棄上清液，用PBS洗滌兩次后，再加入500 μL菌懸液（1×108 CFU／mL），孵育2 h。棄去孔內液體，用PBS洗滌兩次以去除未黏附菌體。加入0.15 mL胰酶消化5 min，待細胞完全脫落后，加入0.35 mL MEM細胞培養液終止消化。采用平板菌落計數法測定黏附菌量，按式（2）計算黏附率（%）。

黏附率=C黏C初×100%（2）

式中：C初表示孵育0 h時活菌量;C黏表示孵育2 h時活菌量。

1.4.4 培養物上清液及菌懸液制備

將培養至對數生長后期的各菌株培養物，在4 ℃下以10 000 g離心10 min，收集上清液，并利用0.22 μm微孔濾膜過濾，獲得無細胞培養物的上清液，于4 ℃冷藏備用。離心所得菌泥經10 mmol／L磷酸鉀緩沖液（PBS，pH 6.8）洗滌兩次，加入等體積PBS溶液重懸菌體，制備菌懸液，于4 ℃冷藏備用。

1.4.5 總抗氧化能力及DPPH自由基清除能力測定

按照試劑盒說明書，測定及計算總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力。對于培養物上清液及菌懸液樣品，無須稀釋，直接進行測定;對于添加刺梨汁的牛乳或發酵乳樣品，則需先稀釋200倍再進行測定。

1.4.6 刺梨汁添加量對牛乳理化特性影響

在牛乳中分別加入不同添加量的（0％、10％、15％、20％、25％，w／w）刺梨汁后，通過測定各樣品的pH值、滴定酸度，蛋白離心沉淀率，維生素C含量以及總抗氧化能力，來確定刺梨汁的最佳添加量。

1.4.7 刺梨風味發酵乳制備

將篩選得到的具有抗氧化潛力的乳酸菌菌株按3％的接種量加入含有15 ％刺梨汁和7％蔗糖的復原全脂乳（11％，w／w）中，在37 ℃下發酵24 h后，測定其pH值和滴定酸度。

在確定刺梨風味發酵乳的發酵菌株后，按0％、10％和15％的添加量將刺梨汁加入牛乳中，再加入7％的蔗糖。溶解后，95 ℃殺菌5 min，再冷卻至30 ℃。按終濃度1×106 CFU／mL接種L.f grx938，并在37 ℃培養24 h。之后，放入4 ℃冷藏24 h，制成刺梨風味發酵乳，并對其pH，酸度、活菌量、感官特性、總抗氧化活性及DPPH自由基清除能力進行測定。

1.4.8 滴定酸度及pH測定

pH測定：在室溫下，利用pH計對樣品的pH值進行測定。

滴定酸度的測定按照國家標準《食品安全國家標準 食品酸度的測定》（GB 5009.239—2016）中的方法測定，總酸度以乳酸計。

1.4.9 離心沉淀率測定

參考汪飛^［9］的方法，略做改動。準確稱取樣品10 g倒入10 mL離心管中， 以3 600 r／min離心15 min后，測定上清液和沉淀物的重量，每個樣品進行3次重復，沉淀率計算如式（3）所示。

離心沉淀率=沉淀物的質量樣品的質量×100%（3）

1.4.10 感官評價

隨機選取10名乳制品專業人員作為感官評定小組成員，并按表2相應評分標準對產品組織狀態、色澤、口感和風味進行評價。

1.4.11 活菌數測定

參照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2023）中的方法，測定產品中乳酸菌總數。

1.4.12 維生素C含量測定

參照楊丹等^［10］的方法，略做改動。

1.4.13 數據處理與分析

每個實驗至少進行3次生物學重復，每次生物學重復至少包括3次技術重復。使用GraphPad Prism 10對數據進行分析，并采用Tukey多重比較檢驗的單因素方差分析。

2 結果與討論

2.1 篩選具有抗氧化功能的乳酸菌

2.1.1 乳酸菌的人工胃腸液耐受性

為篩選具有良好人工胃腸液耐受性的菌株，本研究對受試菌株在人工胃腸液中3 h的存活率進行檢測，結果如圖1和圖2所示。在pH值為2的人工胃液中，菌株的存活率為2.85％～10.81％，其中L.f 559的存活率最高（圖1.A）。在pH值為3的人工胃液中，菌株的存活率顯著提高，在67.72％～92.31％，其中L.f 582的存活率最高（圖1.B）。這表明受試菌株對pH值為3的人工胃液具有較好的耐受能力。

在膽鹽濃度為0.1％的人工腸液中培養3 h后，僅有L.f 564、L.f 572、L.p 576、L.f grx938和L.pe 593菌株存活，存活率為5.55％～34.29％，其中L.pe 593的存活率最高（圖2.A）。在膽鹽濃度為0.3％的人工腸液中培養3 h后，僅有L.f 564、L.f 572、L.p 576和L.f grx938菌株存活，存活率在10.00％～29.76％，其中L.f grx938的存活率最高（圖2.B）。

研究表明：具有良好人工胃腸液耐受性的乳酸菌，在pH 3的人工胃液中3 h的存活率可達到76.10～94.77％，而在人工腸液中3 h的存活率則為32.40%～74.56％^［11-12］。在本研究中，菌株對人工胃液的耐受性表現較好，但對人工腸液的最高耐受性僅為34.29％，這可能是由于膽鹽濃度差異所致。因此，綜合考慮菌株對人工胃液和腸液的耐受能力，選取L.f 572、L.p 576和L.f grx938進行后續實驗。

2.1.2 乳酸菌的黏附特性

為進一步篩選具有良好腸道定植功能的菌株，對上述篩選出的三種菌株對Caco-2細胞的黏附性進行測定，結果如圖3所示。L.f grx938對Caco-2細胞的黏附率顯著高于L.f 572和L.p 576，達到了21.98％（圖3）。通常具有較好黏附性的乳酸菌對Caco-2細胞的黏附率為9.13％～29.47％^［12-13］，這表明本研究中受試的3種乳酸菌菌株均具有較好的黏附特性。

2.1.3 乳酸菌的抗氧化特性

為進一步篩選具有抗氧化特性的菌株，對上述篩選得到的菌株進行了總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力的測定，結果顯示，3種菌株無論是上清液還是菌體的總抗氧化能力均無顯著差異，但菌株上清液的總抗氧化能力是菌體總抗氧化能力的6倍（附圖1.A）。此外，3種菌株的上清液在DPPH自由基清除能力方面也無顯著差異，但是L.p 576菌體的DPPH自由基清除能力顯著高于L.f 572和L.f grx938（Plt;0.000 1，附圖1.B），并且上清液的DPPH自由基清除能力幾乎是菌體的2倍。研究表明，乳酸菌菌體和發酵上清液均對DPPH自由基具有清除能力。例如，田圓圓等^［14］發現菌株L6具有較強的DPPH自由基清除能力，菌懸液的清除率為52.48％；QUAN等^［15］和唐宇等^［16］利用篩選菌株制備的發酵上清液，其DPPH自由基清除能力分別達到了80.25％和94.38％。結合本研究結果，可以看出菌株的抗氧化特性和DPPH自由基清除能力可能主要依賴于乳酸菌的代謝產物。

2.2 刺梨汁添加量對牛乳理化性質影響

刺梨汁呈酸性，其pH值一般在3.0～4.0。過量添加刺梨汁會導致牛乳酪蛋白變性，進而影響發酵乳的穩定性。為了探究刺梨汁添加量對牛乳理化性質的影響，本研究在牛乳中加入了不同比例的刺梨汁進行實驗。結果發現，隨著刺梨汁添加量的增加，牛乳的pH值逐漸下降，而滴定酸度則顯著升高。當添加量達到10％時，牛乳的pH值低于6.0，滴定酸度超過40 °T（圖4）。同時，隨著刺梨汁添加量的增加，牛乳蛋白的沉淀率逐漸上升。當添加量≤15％時，牛乳蛋白的離心沉淀率維持在4%以下;但當添加量超過20％時，牛乳蛋白的離心沉淀率驟增至40％以上，牛乳中會有大量沉淀的生成（圖5）。這表明刺梨汁的添加量控制在15％以內，不會對牛乳蛋白的穩定性產生顯著影響，也不會導致大量沉淀。

牛乳中的維生素C含量和總抗氧化能力隨著刺梨汁添加量的增加而顯著提升，表明添加刺梨汁能有效增強牛乳的抗氧化特性（圖6）。周琪等^［17］和王倩玉等^［18］在制備刺梨酸奶的過程中，分別確定了7.5％和4.0％為刺梨汁的最佳添加量，這明顯低于本研究中使用的刺梨汁添加量。這種差異可能是由牛乳熱處理強度及刺梨汁添加工藝步驟的不同所導致的。綜上所述，當刺梨汁添加量不超過15％時，牛乳蛋白體系較為穩定，且具有抗氧化活性。

2.3 發酵菌株對刺梨風味發酵乳影響

為了篩選適用于刺梨風味發酵乳的菌株，將不同菌株分別接種至復原全脂乳中進行發酵。結果顯示，僅接種L.f grx938的復原全脂乳在37 ℃下發酵24 h后成功凝乳，pH值下降至4.08，滴定酸度達到112.68 °T（圖7）。這可能是由于L.p 576和L.f 572在牛乳中生長較慢，導致產酸過低。因此，選擇L.f grx938菌株作為刺梨風味發酵乳的發酵菌株，該菌株在復原全脂乳中產酸性能良好，并能有效促進復原全脂乳的凝乳過程。

2.4 具有抗氧化功能的刺梨風味發酵乳的制備

選用篩選出的L.f grx938作為發酵劑制備不同刺梨汁添加量的刺梨風味發酵乳，結果顯示，在37 ℃下發酵24 h，隨后于4 ℃冷藏24 h后，所有樣品的滴定酸度均超過80 °T，pH值低于4.7，凝乳狀態良好。當刺梨汁添加量為10％和15％時，發酵乳滴定酸度、pH值及活菌數與未添加刺梨汁的發酵乳樣品均無顯著性差異（附圖2，Pgt;0.05），表明刺梨汁添加量為10%和15％時不會影響L.f grx938的生長。

如表3所示，添加10%刺梨汁后，發酵乳具有較濃郁的刺梨風味，但其口感、組織狀態及色澤指標的評分與不添加刺梨汁的發酵乳無顯著差異（Pgt;0.05）。當刺梨汁添加量增至15%時，各項感官指標評分均顯著高于10%刺梨汁添加量，具體表現為：刺梨果香濃郁純正，口感細膩順滑且酸甜適中，質地均勻無沉淀，色澤均勻有光澤。

如圖8所示，在不添加刺梨汁的情況下，發酵乳中維生素C含量低于檢測限，總抗氧化能力僅為1.337 mmol Trolox/L； 當加入刺梨汁后，這兩個指標均顯著提升（Plt;0.05）。在刺梨汁添加量為10％時， 刺梨風味發酵乳中的維生素C含量為357.5 mg／100 mL，總抗氧化能力為119.36 mmol Trolox/L。當刺梨汁添加量增至15％時，刺梨風味發酵乳中的維生素C含量為進一步提升至473.3 mg／100 mL，總抗氧化能力達到127.87 mmol Trolox/L。

由圖9可知，在不添加刺梨汁時，發酵乳對DPPH自由基的清除能力為78.94％。添加10%和15%刺梨汁后分別提升至90.58%和93.92%。周琪等^［17］的研究表明，原味酸奶的DPPH自由基清除率為36.17％，添加刺梨汁后DPPH自由基清除率超過了80％。本研究中的L.f grx938發酵乳本身已具備較強的自由基清除能力，添加10％或15％的刺梨汁后，其自由基清除能力顯著提高，這表明刺梨汁與L.f grx938菌株在提高DPPH自由基清除能力方面具有協同作用。綜上，刺梨風味發酵乳的制備工藝是選取L.f grx938作為發酵菌株，添加15％（w／w）的刺梨汁，37 ℃發酵24 h制備具有抗氧化功能的刺梨風味發酵乳。

3 結論

本研究篩選獲得一株具有潛在抗氧化功能且適用于刺梨風味發酵乳制備的L.f grx938，并通過評估刺梨汁添加量對產品特性的影響，確定刺梨發酵乳的制備工藝為選用L.f grx938作為發酵菌株，添加 15％的刺梨汁，37 ℃發酵24 h。與不添加刺梨汁的發酵乳相比，該工藝制備的發酵乳不僅刺梨風味濃郁，口感細膩，而且抗氧化能力顯著提升（Plt;0.05）。本研究初步建立了具有抗氧化功能刺梨發酵乳的制備工藝體系，為特色乳制品開發提供了技術支持。未來研究仍需進一步探究刺梨汁與益生菌的協同抗氧化機制，特別是在體外細胞或實驗動物水平評估刺梨風味發酵乳的體內外抗氧化功效。

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Study on the preparation process of Rosa roxburghii flavor fermented milk with antioxidant function

YANG Huandong1， QIN Lanyu2， LIU Min2， ZHAO Xia2， YANG Renqin3， WA Yunchao2， GU Ruixia2

（1.Nanjing Weigang Dairy Co.， Ltd.， Nanjing， Jiangsu 211100， China; 2.School of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127， China; 3.Yangzhou Yangda Kangyuan Dairy Co.， Ltd.， Yangzhou， Jiangsu 225111， China）

Abstract： To develop Rosa roxburghii flavor fermented milk with antioxidant properties， the preparation process was preliminarily explored by screening antioxidant probiotic strains， optimizing the addition ratio of Rosa roxburghii juice， and determining the optimal fermentation strain. The results showed that three outstanding probiotic strains were identified through rigorous screening： Lactobacillus plantarum 576， Lactobacillus fermentum 572， and Lactobacillus fermentum grx938. These strains demonstrated excellent tolerance to artificial gastric and intestinal fluids， strong adhesion to Caco-2 cells， and high antioxidant capacity. With the optimal addition of 15％ Rosa roxburghii juice and the selection of Lactobacillus fermentum grx938 as the fermentation strain， the resulting Rosa roxburghii flavor fermented milk exhibited a rich flavor， balanced sweetness and acidity， and a smooth texture. It achieved a DPPH free radical scavenging rate of 93.92％， a vitamin C content of 473.3 mg／100 mL， and a total antioxidant capacity of 127.87 mmol Trolox/L . These findings provide a solid theoretical and technical foundation for the commercial development of Rosa roxburghii-flavored fermented milk.

Key words： Lactobacillus fermentum; Rosa roxburghii; fermented milk; antioxidant

（責任編輯：曹文磊）