膜芯片技術在肉類食品摻假檢測中的應用

關鍵詞：膜芯片，肉類食品，摻假檢測

0引言

近些年來，肉類食品摻假事件屢見不鮮，一些不法商販用低價肉冒充高價肉甚至用非食用肉類偽裝成食用肉類，不僅損害了消費者的利益，還可能帶來嚴重的食品安全問題[1]。2013年的“馬肉風波”

震驚整個歐洲，瑞典、英國、法國等國家發現部分超市售賣的牛肉漢堡中摻雜了馬肉成分。在我國，肉類食品的摻假現象也十分普遍，目前市面上主要的摻假手段有用價格相對低廉的豬肉、鴨肉偽造牛羊肉，用馬肉冒充驢肉，用豬血、雞血冒充鴨血等，普通消費者僅憑感官或經驗很難加以辨別。

分子生物學技術為肉類食品的鑒定開辟了新的途徑，如PCR、熒光PCR、基因芯片等技術在動物源性成分的鑒別中都有廣泛應用[2-5]。膜芯片技術是一種以硝酸纖維素膜或尼龍膜為支持物的可視基因芯片技術，該技術利用反向斑點雜交原理，將一組特異性寡核苷酸探針固定于支持膜表面，待測樣品PCR產物經變性形成的單鏈DNA與膜芯片上的探針雜交，經化學顯色即可形成肉眼可見的雜交信號點[6-8]。該方法可在一個支持膜上固定多個探針，因此可一次性對樣品中多種動物源性成分進行檢測。

本研究參照GB/T35917—2018《常見動物源性成分快速測定膜芯片法》[9]，采用動物源性成分膜芯片檢測試劑盒對市售的畜禽肉、速凍調理肉制品、動物血制品等肉類食品中11種動物源性成分（包括豬、黃牛、羊、雞、兔、驢、貂、狐、鼠、牦牛、鴨）進行檢測，將檢測結果與標簽比對進行符合性判定，從而了解肉類食品摻假情況，為肉類食品質量安全監管提供依據，并為膜芯片技術在多種肉類食品摻假檢測中的應用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

肉類食品樣品25份，為2021年至2024年從中小型餐館、食堂等抽檢的樣品，包括牛肉及其制品6份、羊肉及其制品7份、豬肉及其制品4份、鴨血制品4份、雞肉制品3份、混合肉制品1份。

QC-AN-003肉糜中豬源性成分定性分析質控樣品（中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心）。

血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；11種動物源性成分膜芯片檢測試劑盒（四川華漢三創生物科技有限公司）。

1.2主要儀器與設備

Quintix224-1CN電子天平（精度0.1mg，德國Sartorius公司）；Scientz-48高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；V4DS025渦旋振蕩器（德國IKA公司）；TUS-200P恒溫金屬浴振蕩器（上海一恒科學儀器有限公司）；5424R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；NanodropOneC超微量分光光度計（美國ThermoFisher公司）；Veriti定性PCR儀（美國ABI公司）；MFS-8基因膜芯片檢測工作站（四川華漢三創生物科技有限公司）；Tacta手動移液器（德國Sartorius公司）。

1.3方法

1.3.1樣品處理與DNA提取

從樣品的不同部位分多點取樣，共約1.0g，置于2mL圓底離心管中，加入不銹鋼珠，用高通量組織研磨器進行研磨處理，鴨血制品如解凍后為液體狀態可不需研磨。稱取研磨后的樣品30mg，鴨血制品可直接吸取200μL，用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒按操作說明提取基因組DNA。提取后的基因組DNA用超微量分光光度計測定濃度和A260/A280比值，DNA濃度應大于100ng/μL，A260/A280比值應在1.8～2.0之間，適宜于PCR擴增。

1.3.2多重PCR擴增

按膜芯片檢測試劑盒說明書配制多重PCR反應體系（總體積為20μL）：多重PCR反應預混液（2×MultiplexPCRMasterMix）10μL，DNA模板5μL，無核酸酶水5μL。同時，用含有11種動物源性成分的基因組DNA為陽性對照，用不含有這11種動物源性成分的基因組DNA為陰性對照，用無核酸酶水為空白對照，作為試驗過程的質量控制。

PCR反應參數：50℃、2min，1個循環；95℃、10min，1個循環；95℃、30s，55℃、30s，68℃、15s，30個循環；68℃、5min，1個循環；4℃，保存。

1.3.3膜芯片雜交

將多重PCR擴增產物于95℃變性5min后，置于4℃保存備用。采用基因膜芯片檢測工作站進行自動雜交。按試劑盒說明書，將已變性的PCR產物加入500μL雜交液（R2）中配制雜交體系液，將堿性磷酸酶標記鏈霉親和素（AP-Streptavidin）按1：250比例加入酶標液（R4）中配制酶標體系液，現配現用。

將配制好的雜交體系液、酶標體系液以及雜交清洗液（R3）、酶標清洗液1（R5）、酶標清洗液2（R6）、顯色液（R7）、膜芯片放入儀器指定位置，加載雜交程序，自動運行雜交過程：雜交（45℃、30min）；雜交清洗（52℃、5min）2次；酶標（42℃、15min）；酶標清洗1（42℃、3min）1次；酶標清洗2（37℃、3min）2次；顯色（37℃、10min）。

1.3.4結果判讀

檢測結果可用肉眼直接判讀，顯藍色斑點為陽性雜交信號，雜交點未顯色為陰性雜交信號，也可用膜芯片掃描儀進行識別分析，結果應與肉眼判讀相一致。膜芯片探針分布如圖1所示，內參為18SrRNA基因探針，PC為陽性雜交對照，NC為陰性雜交對照。PC和NC用于監測雜交過程是否正常，PC點顯色、NC點不顯色表明雜交過程正常，實驗結果有效。

2結果與分析

2.1試驗質量控制

試驗過程的質量控制檢測結果見圖2。空白對照為無核酸酶水，內參和11種成分均未顯色；陽性對照為含有11種動物源性成分的基因組DNA，內參和所有11種成分均有顯色；陰性對照為不含11種動物源性成分的基因組DNA，本實驗采用狗肉基因組DNA作陰性對照，只有內參顯色，11種成分均未顯色。以上結果表明試驗過程質量控制符合要求。

2.2實際樣品檢測

對25份不同類別肉類食品中的11種動物源性成分進行檢測，結果見表1。有2份樣品檢測結果與標簽明示不符。在6份牛肉及其制品中，有1份樣品（編號1）未檢出黃牛成分，而檢出鴨、羊成分，表明該樣品是以鴨肉、羊肉冒充牛肉。在7份羊肉及其制品中，有1份樣品（編號7）檢出鴨、羊成分，表明該樣品用鴨肉摻假。4份豬肉及其制品只檢出豬成分，4份鴨血制品只檢出鴨成分，3份雞肉制品只檢出雞成分，1份混合肉制品檢出豬、雞、鴨成分，以上樣品檢測結果均與標簽明示相符，沒有摻假成分。部分樣品的膜芯片顯色結果見圖3。

2.3質控樣品檢測

對肉糜中豬源性成分質控樣品（QC-AN-003）進行檢測，結果見表2。質控樣品為雞肉基質中添加豬肉的混合肉，結果檢出豬成分，與證書相一致，表明該方法檢測結果準確可靠。

3討論

本研究利用膜芯片技術對本地區抽檢的25份肉類食品中11種動物源性成分進行檢測，被測樣品包含生鮮肉、速凍調理肉制品和鴨血制品，肉源類別涵蓋了常見的牛、羊、豬、雞、鴨5種類別。將檢測結果與產品標簽明示比對判定摻假情況，結果發現有2份牛、羊肉樣品與明示不符，存在以鴨肉冒充、摻假的情況。

本研究所采用的膜芯片技術以多重PCR為基礎，在一張膜芯片上集成了豬、黃牛、羊、雞、兔、驢、貂、狐、鼠、牦牛、鴨等11種動物源性成分的探針，從而實現樣品中11種成分的同時檢測。研究結果表明該技術在多種不同類別的肉類食品樣品中都有較好的應用效果，而且實驗操作簡便，檢測通量高，結果準確可靠，可用于多種肉類食品摻假成分的快速篩查，為肉類食品的質量安全監管提供有效的技術保障。