HERC6可作為腎透明細胞腎細胞癌的預后標志物和潛在治療靶點：基于生信分析和實驗驗證

[摘" "要]" "目的：探討E3泛素連接酶HERC6（hect and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase family member 6）是否可作為腎透明細胞腎細胞癌（kidney clear cell renal cell carcinoma， KIRC）預后的標志物和治療的靶點。方法：用癌癥基因圖譜（the cancer genome atlas， TCGA）數據庫分析在KIRC中HERC6的表達。運用UALCAN數據庫評估HERC6與KIRC的臨床相關性。進行單因素Cox回歸分析，構建HERC6在KIRC的預后模型。探究HERC6表達與免疫細胞浸潤、免疫相關功能以及免疫檢查點之間的關聯性。通過藥物敏感性分析探究HERC6作為靶向治療新靶點的可能。最后，開展5-乙炔基-2？蒺脫氧尿嘧啶摻入測定（5-ethynyl-2？蒺-deoxyuridine incorporation assay， EdU）實驗、劃痕實驗和Transwell實驗，以驗證HERC6在KIRC發生、進展中的作用。結果：HERC6在KIRC中的表達與正常腎組織相比明顯減低（Plt;0.001）。HERC6低表達的患者預后較差，臨床病理特征也更不理想。功能富集分析顯示，HERC6主要參與免疫反應、脂質代謝等生物學過程，進而介導KIRC的發展。免疫相關分析表明，HERC6是KIRC免疫治療的潛在靶點。在KIRC細胞中過表達HERC6進行體外實驗，發現其增殖、遷移和侵襲能力被抑制。結論：HERC6可作為KIRC預后標志物和治療靶點。

[關鍵詞]" "腎透明細胞腎細胞癌；HERC6；預后標志物；治療靶點

[中圖分類號]" "R737.11" " " " " " " "[文獻標志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號]" "1674-7887（2025）01-0014-08

HERC6 can serve as a prognostic biomarker and a potential therapeutic target for kidney clear cell renal cell carcinoma： based on bioinformatics analysis and experimental verification*

YI Xincheng**， JIA Zongming， KONG Ying， GONG Dongkui， HUANG Yuhua***" " " " （Department of Urology， the First Affiliated Hospital of Soochow University， Jiangsu 215000）

[Abstract]" "Objective： To explore whether the E3 ubiquitin-ligase hect and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase family member 6（HERC6） can serve as a prognostic marker and therapeutic target for kidney clear cell carcinoma（KIRC）. Methods： The cancer genome atlas（TCGA） database was used to analyze the expression of HERC6 in KIRC. The UALCAN database was applied to evaluate the clinical correlation between HERC6 and KIRC. Univariate Cox regression analysis was carried out to construct a prognostic model of HERC6 in KIRC. The correlations between HERC6 expression and immune cell infiltration， immune-related functions， and immune checkpoints were investigated. The potential of HERC6 as a new target for targeted therapy was explored through drug sensitivity experiments. Finally， 5-ethynyl-2？蒺-deoxyuridine incorporation assay（EdU）， wound-healing， and Transwell assays were conducted to verify the role of HERC6 in the occurrence and progression of KIRC. Results： The expression of HERC6 in KIRC was significantly lower compared with that in normal renal tissues（Plt;0.001）. Patients with low HERC6 expression had a poorer prognosis and less favorable clinicopathological features. Functional enrichment analysis showed that HERC6 was mainly involved in biological processes such as immune response and lipid metabolism， thus mediating the development of KIRC. Immune-related analysis indicated that HERC6 has the potential to be a candidate target for immunotherapy of KIRC. In vitro experiments by overexpressing HERC6 in KIRC cells showed that the proliferation， migration， and invasion abilities were inhibited. Conclusion： HERC6 can serve as a prognostic biomarker and a therapeutic target for KIRC.

[Key words]" "kidney clear cell renal cell carcinoma; hect and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase family member 6; prognostic marker; therapeutic target

腎臟的實質惡性腫瘤中發病率最高的是腎細胞癌（renal cell carcinoma， RCC）[1]。腎透明細胞腎細胞癌（kidney clear cell renal cell carcinoma， KIRC）是RCC最常見的亞型，相比其他亞型，其預后差、侵襲力強、復發率高[2]。局部KIRC可通過腎部分切除術或根治性腎切除術治療[3]。然而，RCC轉移時其臨床預后相對較差，且化療對轉移性KIRC的治療效果不佳[4-5]。分子靶向藥物是晚期腎癌的一線治療藥物，但其耐藥問題突出，研究與腎癌進展相關的分子以尋找新治療靶點具有重要意義。此外，研究[6-8]表明許多惡性腫瘤的進展和轉移與T細胞功能障礙和免疫檢查點相關的免疫抑制有關。免疫檢查點抑制劑（immune check-point inhibitors， ICI）阻斷程序性死亡受體1（program-med cell death protein 1， PD-1）或細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4， CTLA-4）與配體結合以減輕腫瘤免疫抑制，已廣泛應用于臨床治療[9-10]。因此，探尋敏感且具特異的新型生物標志物對KIRC的臨床診療具有重要意義。

HERC6（hect and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase family member 6）蛋白是屬于HECT（homologous to E6AP C-terminus）家族的E3泛素連接酶。HERC家族共由6個成員組成，按分子質量大小分為大HERCs（HERC1和HERC2）和小HERCs（HERC3-HERC6）。HERCs對細胞增殖、細胞遷移、免疫反應、DNA損傷反應和神經發育等具有調節作用，其改變對癌癥有顯著影響[11]。越來越多的研究發現HERC家族在癌癥中起著關鍵作用。N.J.YOO等[12]發現在微衛星不穩定的胃癌和結直腸癌中出現了HERC2移碼突變。L.BONANNO等[13]發現HERC2的表達水平與非小細胞肺癌患者的生存率呈負相關。D.ZHU等[14]發現HERC2結合蛋白SOX18的上調會增強骨肉瘤細胞的增殖。T.SCHNEIDER等[15]發現大分子HERCs高表達與多種癌癥患者的預后較好相關。然而，目前HERC6在KIRC中的研究較少，其作用尚不明確。

本研究通過使用生物信息學方法分析HERC6在KIRC中的作用。通過開展體外實驗驗證HERC6的表達增加對KIRC細胞增殖、侵襲能力的影響。此外，通過免疫相關分析及藥物敏感性分析探究HERC6成為KIRC免疫治療標志物、藥物治療新靶點的可能。

1" "資料與方法

1.1" "基因表達和生存分析" "TIMER2數據庫（http：//timer.cistrome.org/）被用于分析腫瘤組織與癌旁正常組織間HERC6的表達情況。從癌癥基因組圖譜（the

cancer genome atlas， TCGA）數據庫中下載了包含542份KIRC樣本和72份正常腎組織樣本的mRNA測序數據以及相應的臨床信息。本研究共納入其中533例臨床資料完整的KIRC患者。使用R語言（v4.2.2）分析TCGA-KIRC數據集中KIRC組織與正常腎組織及配對樣本之間HERC6的表達情況，并運用“ggpubr”和“ggplot2”這兩個R語言軟件包進行可視化處理。運用“survival”R包對生存數據進行統計分析。

1.2" "臨床相關性分析" "利用TCGA-KIRC的臨床數據，分析HERC6表達與KIRC患者臨床特征之間的相關性，這些臨床特征包括年齡、腫瘤分級、臨床分期以及TNM分期。

1.3" "預后分析和列線圖模型構建" "對HERC6的表達與KIRC預后的關系進行評估，使用R語言“survival”包進行單因素Cox回歸分析。此外，利用“rms”R包構建列線圖，并運用“regplot”R包預測KIRC患者1、3和5年的總生存期（overall survival， OS）。

1.4" "功能富集分析" "對差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）進行功能富集分析（gene set enrichment analysis， GSEA），使用R語言中的“ClusterProfiler”包和“enrichplot”包，在GO和KEGG層面發掘潛在的分子機制。Plt;0.05為差異有統計學意義。

1.5" "免疫分析及藥物敏感性分析" "利用“CIBERSORT”包計算所有樣本中22個免疫細胞亞群的豐度，選擇Plt;0.05的樣本進一步分析，以比較各種免疫細胞的浸潤在HERC6高表達組和低表達組之間的差異。使用Kaplan-Meier（http：//kmplot.com/）數據庫分析HERC6的表達與KIRC患者在不同免疫細胞亞群中OS之間的關系。使用“ESTIMATE”來計算KIRC的基質評分和免疫評分。分析基質/免疫評分與HERC6表達之間的關系。使用R語言的“GSEABase”和“GSVA”包對單樣本基因集富集分析，以評價免疫相關功能，并對所得評分進行校準，用于比較HERC6高、低表達組之間免疫相關功能的差異。進一步分析HERC6表達與免疫檢查點相關基因表達水平之間的關聯性。用腫瘤免疫圖譜（the cancer immunome atlas， TCIA）數據庫（https：//tcia.at/home），計算分析不同組間樣本的免疫表型評分（immunophenoscore， IPS）。使用“pRophetic”R包預測抗腫瘤藥物的IC50。

1.6" "細胞培養與質粒轉染" "人KIRC細胞系（786-O細胞）在含有5% CO2的濕潤環境中，于37 ℃下，在含有10%胎牛血清（Gibco，美國）和1%青霉素/鏈霉素溶液（碧云天，中國）的RPMI1640培養基（Gibco，美國）中進行培養。根據說明書，用Lipofectamine 2000轉染試劑（Invitrogen，美國）將質粒轉染至786-O細胞中。轉染后繼續培育細胞，后續使用RIPA緩沖液（碧云天，中國）提取總蛋白。

1.7" "蛋白免疫印跡實驗" "將所提蛋白樣品上到SDS-PAGE凝膠，再轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉該膜2 h，然后在4 ℃下與相應的一抗（680303，ZENBIO）孵育過夜。最后，使用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育該膜，并通過增強化學發光試劑盒（碧云天，中國）進行曝光。

1.8" "5-乙炔基-2？蒺脫氧尿嘧啶摻入測定（5-ethynyl-2？蒺-deoxyuridine incorporation assay， EdU）檢測" "自碧云天公司購EdU檢測試劑盒（C0078S，中國）。按使用說明，加入EdU試劑孵育細胞3 h。然后，室溫下用4%多聚甲醛固定細胞15 min，清洗后用0.3%Triton X-100常溫下孵育15 min。最后，用熒光染料和Hoechst對細胞進行染色。使用尼康TI2-D-PD倒置顯微鏡（日本）采集圖像。

1.9" "遷移和Transwell侵襲實驗" "將786-O細胞于對數生長期接種到6孔板中培養24 h，當細胞生長至90%以上時用20 μL移液器槍頭在6孔板細胞上劃一道劃痕，然后用PBS液清洗細胞。接著，在37 ℃下用含1%胎牛血清（Gibco，美國）的培養基繼續培養細胞24 h，分別在0、24 h時拍照記錄。

對于Transwell實驗，將5×104個細胞接種到24孔Transwell小室（Corning，美國）中，小室底部鋪有一層基質膠（Corning，美國）（基質膠∶無血清培養基=1∶6）。36 h后，在室溫下用4%多聚甲醛固定Transwell小室上層的細胞20 min，然后用結晶紫（中國生工生物工程股份有限公司）染色20 min。使用尼康TI2-D-PD倒置顯微鏡（日本）采集圖像。

1.10" "統計學方法" "所有數據均使用R語言（v4.2.2）進行分析。單因素Cox回歸分析用于分析預后因素。所有統計分析均使用GraphPad Prism 9.0軟件進行。采用Student？蒺s t檢驗比較兩組之間的差異，Plt;0.05認為差異有統計學意義。

2" "結" " " 果

2.1" "HERC6在KIRC中顯著下調" "通過對TIMER" "數據庫挖掘分析，獲取HERC6在泛癌角度的表達水平。HERC6在包括KIRC在內的3種癌癥類型中表達下調（圖1A）。與正常腎組織相比，HERC6 mRNA水平在KIRC中表達顯著下調（圖1B～C）。據Kaplan-Meier生存曲線所示，HERC6低表達與KIRC患者的預后不良相關（圖1D）。HPA數據庫中A-431和U2OS細胞的免疫熒光結果顯示，HERC6定位于細胞質中（圖1E）。

2.2" "HERC6的低表達與不良的臨床病理特征相關" "使用UALCAN數據庫對HERC6表達與相應臨床病理特征之間的相關性進行分析，以探索HERC6在KIRC中的臨床作用。如圖2A～D所示，在KIRC患者中，HERC6的表達與腫瘤分級、臨床分期、N分期顯著相關。在KIRC中，HERC6表達水平越低，病理分級越差，臨床分期越晚，N分期越高。

2.3" "HERC6是KIRC的預后因素" "使用單因素Cox回歸分析進一步評估HERC6在KIRC中的預后價值。單因素Cox分析結果顯示，HERC6的表達（P=0.003）、年齡（Plt;0.001）、腫瘤分級（Plt;0.001）和臨床分期（Plt;0.001）是影響KIRC患者OS的顯著因素（圖3A）。基于此發現，構建了一個包含HERC6表達和臨床參數的列線圖，用于預測KIRC患者1、3和5年的OS（圖3B），列線圖上得分越高可以說明患者的預后越差。如圖3C所示，在觀察1、3和5年生存率方面列線圖校準曲線具有良好的可靠性。

2.4" "HERC6可能在KIRC發生及發展過程中調節免疫、脂質代謝進程" "根據HERC6表達的中位數，將TCGA-KIRC患者分為高風險組和低風險組，以探究HERC6潛在的分子功能。基于高、低風險組之間的差異表達分析，共鑒定出148個DEGs，其中111個基因上調，39個基因下調（|log2倍變化|gt;1且錯誤發現率lt;0.01。如圖4A所示為HERC6高表達組和低表達組之間上調和下調幅度排名靠前的基因。如圖4B所示，GO富集分析在生物學進程（biological process， BP）、細胞組成（cellular component， CC）和分子功能（molecular function， MF）3個層次上均顯示DEGs參與脂質代謝相關功能。在GO-BP領域，這些基因富集于細胞凋亡調控和蛋白-脂質復合物重塑。在GO-CC領域，這些基因與多種脂蛋白顆粒相關。在GO-MF領域，觀察到膽固醇結合、甾醇結合、抗氧化活性等在功能上顯著富集。如圖4C所示，DEGs在膽固醇代謝、神經活性配體-受體相互作用、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路等KEGG通路中顯著富集。如圖4D～E所示，GSEA富集分析顯示DEGs在補體激活的調節、體液免疫反應的調節等功能上富集。

2.5" "在KIRC中HERC6的表達與免疫特征相關運用" "ESTIMATE方法探究HERC6在KIRC免疫微環境中的作用，分析HERC6表達與免疫細胞浸潤之間的相關性。如圖5A所示，HERC6低表達組的調節性T細胞（regulatory T cells， Tregs）和M0型巨噬細胞浸潤水平高于HERC6高表達組，而HERC6低表達組的M1型巨噬細胞浸潤水平低于HERC6高表達組。如圖5B所示，在不同免疫細胞類型與HERC6相關性分析中，Tregs和M0型巨噬細胞與HERC6呈負相關，M1型巨噬細胞與HERC6呈正相關。此外，本研究還應用 ESTIMATE算法計算基質評分、免疫評分和ESTIMATE評分，如圖5C所示，HERC6表達水平越高，基質評分和ESTIMATE評分越高。這提示KIRC中HERC6的高表達可能部分通過影響免疫細胞浸潤來影響患者預后。另外，本研究對HERC6與免疫檢查點基因相互影響進行了評估。如圖5D所示，在HERC6高表達組中，大多數免疫檢查點基因顯著增加，如CTLA-4和CD274，并且HERC6與絕大多數免疫檢查點分子表達呈正相關（圖5E）。通過TCIA數據分析，結果顯示CTLA-4陽性/PD-1陽性組的IPS評分具有統計學意義，且在HERC6高表達組IPS評分更高（圖5F）。綜上所述，HERC6可能在KIRC的免疫逃逸中發揮潛在作用，可作為KIRC免疫治療的潛在靶點。

2.6" "基因突變與藥物敏感性" "腫瘤突變負荷（tumor mutation burden， TMB）是指腫瘤中每百萬個堿基中發生突變的堿基數，常被用于預測患者的治療效果。如圖6A所示，較高的TMB被觀察到集中在HERC6低表達組。由于靶向治療是晚期KIRC的一種新興治療方法[5]，因此對兩組患者對靶向藥物的反應進行了研究。結果表明，低HERC6表達組的患者更適合使用索拉非尼（圖6B）。

2.7" "實驗驗證" "選取786-O細胞系行功能實驗，用于驗證生物信息學分析的結果。如圖7A～B所示，HERC6在786-O細胞中成功實現過表達，且EdU檢測表明，HERC6的過表達顯著抑制了細胞增殖。同時，如圖7C～D所示，HERC6過表達顯著降低了786-O細胞的遷移和侵襲能力。

3" "討" " " 論

RCC是第三大最常見的尿路惡性腫瘤，KIRC是其典型的病理亞型。外科切除是治療KIRC患者的理想途徑，可惜的是術后不少患者腫瘤復發[16-17]。因此，探尋新的藥物治療靶點和免疫調節相關的新生物標記對KIRC的精準和個性化治療具有重要意義。

HERC6是小分子HERCs，參與調節細胞增殖、細胞遷移和免疫反應等[11]。本研究顯示，KIRC中HERC 6的表達顯著低于正常腎組織，其低表達與KIRC的腫瘤發生和進展相關。在TCGA-KIRC臨床隊列中，HERC6的表達水平與腫瘤分級、臨床分期、N分期呈負相關，且HERC6表達較低的KIRC患者預后較差。單因素Cox分析表明，HERC6是KIRC的預后指標。體外實驗證實過表達HERC6使KIRC細胞的增殖、侵襲受到抑制。綜上，HERC6可能是KIRC的一種抑制因子。

脂質在正常細胞中功能多樣，常作為細胞膜組成成分、信號配體或能量儲存物質，脂質代謝發生改變是癌癥的一個基本特征[18-19]。組織學上，KIRC具有獨特的脂質代謝特征，呈現出類似脂肪細胞的儲存表型[20-21]。由此推測KIRC可能利用脂肪因子信號傳導來促進其侵襲性生長[21]。為探究HERC6潛在的分子功能，通過高、低風險組差異表達分析鑒別出DEGs，GO和KEGG富集分析顯示HERC6可能參與脂-蛋白顆粒復合、甾醇結合、膽固醇代謝等。不過，目前HERC6在脂質代謝中的作用研究較少，機制不明，有待深入分析。

腫瘤微環境由腫瘤細胞、多種基質細胞及細胞因子、趨化因子等組成[22-24]，腫瘤浸潤性免疫細胞是其重要組成部分，與腫瘤的發生、進展或轉移密切相關[25-26]。免疫細胞在腫瘤微環境中受調節功能發生變化，營造出利于腫瘤細胞免疫逃逸和耐藥的免疫抑制環境[26]。本研究顯示，HERC6高表達組的免疫評分和基質評分高于HERC6低表達組，說明前者有更豐富的免疫細胞浸潤。但同時，對比兩組之間免疫細胞分布的差異發現Tregs和M0型巨噬細胞在HERC6低表達組中更富集，M1型巨噬細胞在HERC6高表達組中更富集。Tregs細胞是T細胞的一個亞群，具有免疫抑制作用，其可通過削弱效應T細胞的功能以抑制抗腫瘤免疫并促進癌癥進展[27-29]。經典途徑激活的M1型巨噬細胞具有較強的抗腫瘤作用，參與腫瘤細胞的殺傷和吞噬[30]。HERC6低表達組中Tregs細胞大量浸潤可能通過抑制免疫反應促進KIRC的進展，同時該組中具有殺滅腫瘤細胞作用的M1型巨噬細胞浸潤較少，這與該組患者預后較差的情況相符。GSEA富集分析發現HERC6可能參與補體激活的調節、體液免疫反應等免疫活動。PD-1和CTLA-4是活化T細胞表達的免疫抑制受體，能夠負調控T細胞活化的各個階段[31]。本研究對比HERC6高、低表達組在免疫功能上的差異，并評估了兩組在免疫檢查點方面的差異，發現HERC6的表達與PD-1和CTLA-4的表達呈正相關。此外，TCIA數據庫分析表明CTLA-4陽性/PD-1陽性組的IPS評分最高，且HERC6高表達組的IPS評分相對更高。HERC6可能在調節KIRC的腫瘤免疫中發揮作用，高表達HERC6的KIRC患者對ICI應答更敏感，更易從免疫治療中獲益。HERC6低表達組對免疫治療敏感性較低，且其是KIRC不良的預后因素，考慮到靶向治療仍是晚期KIRC患者的一線治療方法[3]，為此本研究進行了藥物敏感性分析。結果顯示，HERC6低表達患者更易從索拉非尼的治療中獲益。

綜上所述，生物信息學研究表明HERC6可能在KIRC的發生發展中起到重要作用，有望成為判斷KIRC預后的新型標志物，可用于預測ICI及靶向治療的臨床獲益。本研究仍存在一定的局限性，首先，結論尚未通過體外或體內實驗驗證；其次，HERC6在KIRC發生、免疫浸潤和脂質代謝等方面的具體分子機制尚未深入探討，有待進一步研究。

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[收稿日期] 2024-12-12